細胞內(nèi)代謝過程除以碳骨架結(jié)構(gòu)改變?yōu)橹鞯奈镔|(zhì)轉(zhuǎn)化外， 通常還伴隨輔因子介導(dǎo)的能量轉(zhuǎn)移。 物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量轉(zhuǎn)移高度耦合， 顯著增加了代謝系統(tǒng)的復(fù)雜度。 氧化還原輔因子通過在氧化態(tài)和還原態(tài)之間循環(huán)再生傳遞電子， 將物質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑關(guān)聯(lián)成復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)[1]. 據(jù)不完全統(tǒng)計， 在微生物中僅吡啶核苷 酸 輔 酶 （nicotinamide adenine dinucleotide（phosphate）， NAD（P））及其還原態(tài)參與的生化反應(yīng)就超過 1000 種[2], 這還不包括它們參與的其他生物學(xué)過程。 傳統(tǒng)生物化學(xué)研究提供了大量生物學(xué)元件[3,4],系統(tǒng)生物學(xué)研究建立了各種代謝模型[5,6], 分子生物學(xué)發(fā)展提供了有效的遺傳操作方法， 使設(shè)計和構(gòu)建新的高效、受控的物質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑成為可能。 然而， 輔因子在代謝網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點作用使各種生化反應(yīng)建立起復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)， 極大地影響了外源途徑在底盤細胞代謝環(huán)境中的功能。 以氧化還原代謝為例，新途徑可能破壞宿主內(nèi)源氧化還原平衡， 從而抑制生長， 使新途徑難以產(chǎn)生預(yù)期效果[7]. 人工構(gòu)建的外源途徑對底盤細胞中天然代謝網(wǎng)絡(luò)的相互干擾， 特別是氧化還原環(huán)境的干擾， 是影響外源合成途徑與底盤細胞適配性的重要因素。 通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)輔因子水平， 如控制酶的表達水平、優(yōu)化代謝途徑、改造酶的輔因子偏好性以及敲除競爭代謝途徑等， 可以優(yōu)化外源途徑與底盤細胞的適配性， 在一定程度上提高代謝調(diào)控效率[8~10]. 但輔因子擾動的生物學(xué)效應(yīng)的可控性和可預(yù)見性低。 例如， 琥珀酸生產(chǎn)需要維持胞內(nèi)較高 NADH 水平， 但高 NADH 水平影響菌株對培養(yǎng)條件的適應(yīng)性[11]. 設(shè)計脂肪酸生產(chǎn)菌株時需要使脂肪酸合成途徑與宿主 NADPH 供給能力相匹配， 但由于無法確定擾動 NADPH 水平對代謝造成的全局性影響， 無法預(yù)測合適的外源基因表達強度， 需要篩選不同表達強度的啟動子表達外源基因[12]. 輔因子關(guān)聯(lián)作用導(dǎo)致的復(fù)雜性也是限制代謝途徑可移植性的重要因素。 例如， 在大腸桿菌（Escherichia coli）中構(gòu) 建 的 高 效 丁 醇 合 成 途 徑 , 移 植 到 藍 細 菌（Cyanobacteria）中就難以達到積累丁醇的效果， 因為藍細菌傾向于積累 NADPH 而非 NADH[13,14].

　　因此， 提高人工代謝途徑在底盤細胞中的適配性、可預(yù)見性和可移植性需要降低代謝系統(tǒng)， 特別是輔因子依賴型氧化還原系統(tǒng)的復(fù)雜度。

1 正交氧化還原體系

　　為降低代謝系統(tǒng)復(fù)雜度， 可設(shè)計獨立于生長代謝的合成途徑及獨立的輔因子循環(huán)再生體系。 這種在復(fù)雜代謝體系中執(zhí)行系統(tǒng)子功能， 并且其執(zhí)行過程獨立于系統(tǒng)其他組件的子系統(tǒng)稱為正交體系。 正交體系的設(shè)計構(gòu)建過程即“正交化”[15]. 正交氧化還原體系是指電子傳遞獨立于系統(tǒng)其他氧化還原輔因子系統(tǒng)的一種氧化還原體系。 目前主要有兩種策略可用于構(gòu)建正交氧化還原體系： （ⅰ） 在空間上分隔輔因子依賴型體系， 即“空間正交氧化還原體系”; （ⅱ） 構(gòu)建利用人工輔因子代替天然輔因子的體系， 即“生物正交氧化還原體系”[8,15]. 設(shè)計構(gòu)建正交氧化還原體系， 是減少外源途徑對底盤細胞中天然代謝網(wǎng)絡(luò)的干擾， 提高外源合成途徑與底盤細胞適配性的重要策略。 以下綜述正交氧化還原體系的設(shè)計和應(yīng)用特點。

2 空間正交氧化還原體系

　　空間正交氧化還原體系通過將相關(guān)的酶及輔因子限定在特定區(qū)域， 提高局部底物和輔因子濃度、減少或避免與其他子系統(tǒng)的相互作用[16,17], 目前主要通過構(gòu)建融合蛋白和設(shè)計蛋白錨定支架實現(xiàn)， 并已有多個成功應(yīng)用的報道。 另外， 最近發(fā)現(xiàn)， 細胞內(nèi)可形成一些特殊的微區(qū)室（microcompartment）， 可以有效限制輔因子或代謝中間體擴散， 從而避免胞內(nèi)輔因子水平干擾微區(qū)室內(nèi)氧化還原代謝[18,19]. 利用微區(qū)室也可構(gòu)建空間正交氧化還原體系[15].

　　蛋白融合技術(shù)通過基因工程手段將多個酶用短肽序列連接形成融合蛋白， 通過調(diào)整連接肽特性和酶的連接方向控制酶的空間定位（圖 1A）， 優(yōu)化級聯(lián)催化過程中底物和能量傳遞[20]. 蛋白錨定支架技術(shù)通過調(diào)整支架上的錨定位點距離、各種錨定位點的數(shù)量和連接肽特性 3 種方式調(diào)整酶的空間定位和比例（圖 1B）， 可降低代謝網(wǎng)絡(luò)對目標(biāo)途徑的影響， 提高目標(biāo)途徑底物和輔因子的局部濃度， 減少與環(huán)境的相互影響[21].

　　兩種空間正交氧化還原體系構(gòu)建策略都受到連接肽特性的影響， 由于連接肽及蛋白結(jié)構(gòu)和功能的多樣性， 需要通過篩選確定合適的連接肽柔性和長度， 優(yōu)化酶的空間定位[2,22]. 連接肽通常使用柔性序列 GGGGS（G4S）[23~26], 通過調(diào)整其拷貝數(shù)改變連接肽長度， 但有時利用剛性氨基酸延長連接肽效果更好， 如將惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）細胞色素 P450（P450cam）、假單胞氧還蛋白（putidaredoxin,P d X ） 和假單胞氧還蛋白還原酶 （ p u t i d a r e d o x i nreductase, PdR）分別與硫磺礦硫化葉菌（Sulfolobussolfataricus）的增殖細胞核抗原（proliferating cellnuclear antigen, PCNA）融合時， 比較兩組連接肽G4S-（P5）n-G4S（n=1~5）和（G4S）n（n=1~6）效果， 以 G4S-（P5）4-G4S 連接時活性最高（（6.5±0.3） μmol/（L min））， 而（G4S）n（n=1~6）最高活性（G4S）5約為 5 μmol/（L min）[22].相比于柔性， 調(diào)節(jié)連接肽長度效果通常更顯著， 上述實例中最適連接肽長度對應(yīng)活性比 n=1 時提高兩倍。

　　長度選擇也是最常見的連接肽優(yōu)化方式。 在 P450 單加氧酶CinA的C-末端融合黃素氧還蛋白CinC, 催化桉樹醇轉(zhuǎn)化為 2-羥基-桉樹醇， 發(fā)現(xiàn)當(dāng)連接肽長度為10 個氨基酸時產(chǎn)量最高， 少于 4 個氨基酸時檢測不到催化活性[2].

　　除了連接肽特性， 空間正交氧化還原體系構(gòu)建還需要綜合優(yōu)化多種因素以在提高體系獨立性的同時獲得更好的催化活性。 構(gòu)建融合蛋白要考慮融合方 向 對 催 化 效 率 的 影 響 . 將 丙 酮 丁 醇 梭 菌（Clostridium acetobutylicum）來源的氫酶（hydrogenase,H2ase）融合鐵氧還蛋白（ferredoxin, FD）促進產(chǎn)氫時，用 2 個氨基酸殘基連接時， FD 連在 H2ase 的 C-末端對產(chǎn)氫過程無促進作用， 而連在 N-末端氫氣產(chǎn)量提高約 3 倍[26]. 這是因為 H2ase 與 FD 作用位點在氫酶N-末端， N-末端融合更利于兩個蛋白相互作用。 這種融合蛋白組合的催化效率也受連接肽長度的影響，以14個氨基酸殘基連接效果最好， 產(chǎn)氫效率提高近5倍， 延長至 46 個氨基酸殘基幾乎沒有促進作用[26].

　　與蛋白融合技術(shù)相比蛋白錨定支架技術(shù)可更自如地設(shè)計酶的空間分布和計量關(guān)系[27,28]. 仍以上述H2ase 與 FD 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)氫途徑為例： 將真核信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的 PDZ（postsynaptic density protein of 95kilodaltons, disc large, zona occludens-1）， SH3（sarcoma homology 3）和 GBD（gelatin binding domain）3 種結(jié)構(gòu)域整合到支架蛋白上， 通過配體肽段將催化生物合成的酶特異性結(jié)合到支架蛋白的對應(yīng)位置，這種設(shè)計可以通過調(diào)整 H2ase 和 FD 在支架上的結(jié)合位置、酶與支架配體間連接肽的`長度、結(jié)合域數(shù)量等調(diào)整酶的空間分布與比例[26]. 結(jié)合域在支架上間距靠近時產(chǎn)氫效率高； 結(jié)合域相對位置相同， FD 與支架蛋配體白的連接肽長度分別為 10, 20, 40 個氨基酸時， 延長肽鏈長度可使氫氣產(chǎn)量提高 3~5 倍； 通過調(diào)整支架蛋白上的 PDZ, SH3 和 GBD 結(jié)合域比例調(diào)整FD:H2ase 比率， 比率越小產(chǎn)氫效率越高[26].

　　除了蛋白， DNA, RNA 等大分子也可作為蛋白錨定支架[20,29,30], 并且隨著 DNA 合成技術(shù)發(fā)展及對DNA, RNA 結(jié)構(gòu)預(yù)測能力的提高， 基于核酸的支架受到更多重視。 利用 DNA 整合 NAD（P）H: 黃素單核苷酸（flavin mononucleotide, FMN）氧化還原酶和熒光素酶， 還原力 NADH 經(jīng)過 NAD（P）H:FMN 氧化還原酶傳遞給 FMN, 然后傳遞給熒光素酶， 與分別連在兩條不同 DNA 鏈上的游離狀態(tài)相比， 連在同一 DNA鏈上時活性提高到 2~3 倍[31]. 支架可以是單個分子，也可以是可自組裝的蛋白亞基。 如將前述 P450cam,PdX, PdR 和亞磷酸脫氫酶分別與 PCNA 融合時， 構(gòu)建融合蛋白 PCNA-PdR, PCNA-P450cam 和 PTDH-PCNA-PdX, 3 個融合蛋白的 PCNA 亞基通過自組裝形成三聚體將 4 個酶進行空間整合， 促進反應(yīng)中的電子傳遞， 組裝復(fù)合體比游離酶催化速率提高 2 倍[22,32].

　　以上空間正交氧化還原體系的應(yīng)用表明， 通過減少天然氧化還原體系的干擾， 可以有效提高目標(biāo)氧化還原體系的效率和可預(yù)見性。