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芝麻素減輕自發性高血壓大鼠腎臟纖維化作用及其機制討論論文

實用文 時間:2021-08-31 手機版

  原發性高血壓是發病率較高的常見疾病。發病率呈逐年上升趨勢,若不及時治療,可發展為慢性腎衰竭或尿毒癥而危及生命。目前,高血壓腎病機制尚不十分清楚,其主要的病理改變為腎間質纖維化與腎小球硬化。其中腎間質纖維化是決定腎臟疾病發展和預后的重要因素,是所有原發或繼發慢性腎臟疾病進展至終末期腎衰竭的共同途徑。芝麻素( sesamin,Ses) 是從芝麻中提取出來的有效活性成分,具有調節血壓、血脂,保護與改善肝腎功能及抗腫瘤等藥理作用。本課題組前期研究已證實,Ses 具有減輕自發性高血壓大鼠腎損傷的保護作用,但深入的機制尚不清楚。本實驗以自發性高血壓大鼠( SHR) 為研究對象,探討Ses 減輕大鼠腎臟纖維化的作用及其可能存在的機制。

芝麻素減輕自發性高血壓大鼠腎臟纖維化作用及其機制討論論文

  1 材料與方法

  1. 1 藥品和試劑

  芝麻素( 分子式C20H15O6,相對分子質量354. 34,純度≥98%) ,購自上海純優生物科技有限公司; 卡托普利片( 批號:13030711) ,購自常州制藥廠有限公司; 丙二醛( MDA) 、超氧化物歧化酶( SOD) 、BCA( bicinchoninicacid) 蛋白濃度檢測試劑盒、α-平滑肌肌動蛋白( α-SMA,批號: AA132) 抗體均購自碧云天生物技術研究所; 轉化生長因子-β1( TGF-β1,批號:BA0290 ) 、基質金屬蛋白酶-9 ( MMP-9,批號:BA2202) 、基質金屬蛋白酶的組織抑制劑-1( TIMP-1,批號: BA3727) 抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。

  1. 2 儀器

  ALC-NIBP 無創尾動脈血壓測定分析系統( 上海奧爾科特生物科技有限公司) ; DYCP-34A 型電泳槽、DYY-Ⅲ-8B 穩壓穩流電泳( 北京六一儀器廠) ; Mini PROTEAN 轉膜系統、MiniPROTEAN 電泳系統( 美國Bio-Rad 公司) ; CS-15臺式離心機( Beckman Coulter) ; SIEMENS RXLMAX全自動生化儀( 上海西門子有限公司) 。

  1. 3 實驗

  動物及分組10 周齡雄性SHR 大鼠28 只,WKY 大鼠7 只,體質量180 ~ 200 g,由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供,許可證號為SCXK ( 滬) 2012-0002, 合格證號為2007000552035。大鼠每4 只1 籠進行飼養,自然光照,室溫( 23 ± 2) ℃,相對濕度60% ~ 65%,動物可自由進食飲水。SHR 大鼠適應性喂養3周后,隨機分為4 組: 模型( SHR) 組、芝麻素低、高( 80、160 mg /kg) 劑量組及卡托普利( 30 mg /kg)組,以同周齡WKY 大鼠作為對照組。按上述設定劑量灌胃給藥,每日一次,連續12 周。

  1. 4 測量

  血壓采用尾動脈無創測壓法。在干燥、安靜的環境中,將清醒狀態下的大鼠放置于37 ℃ 恒溫袋內預熱15 min,用ALC-NIBP 無創血壓計測量尾動脈舒張壓,在大鼠安靜狀態下連續測定3 次,每次間隔1 ~ 2 min,取其平均值。

  1. 5 生化指標檢測

  全自動生物化學分析儀測定各組大鼠血清肌酐( Scr) 、尿素氮( BUN) 和尿微量白蛋白( U-mAlb) 含量; 黃嘌呤氧化酶法測定SOD; 硫代巴比妥酸法測定MDA。具體方法、操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

  1. 6 腎臟病理學變化

  觀察給藥12 周后, 10%水合氯醛( 0. 33 g /kg,i . p. ) 麻醉各組大鼠,取腎臟組織,置入4%多聚甲醛溶液中固定48 h 后,常規石蠟包埋、切片、脫蠟、水化等,進行HE 和Masson染色,光鏡下觀察腎臟病理學變化。

  1. 7 免疫組織化學法測

  TGF-β1、α-SMA 陽性細胞的表達按照厚度約為5 μm/片的標準將各組大鼠腎臟石蠟橫斷面連續切5 ~ 6 片,切片常規脫蠟至水。嚴格按照免疫組化試劑盒說明書操作。將免疫組化染色的切片在光鏡下統一放大10 ×40 倍,采用Image-pro plus 圖像分析軟件進行半定量分析,將每只大鼠腎組織染色切片各取5 個相同單位面積的區域,棕黃色顆粒為陽性細胞,測定TGF-β1及α-SMA 陽性細胞的積分光密度值( IOD) ,計算其平均積分光密度值( AIOD) 。

  1. 8 Western blot 測TGF-β1、α-SMA、MMP-9、TIMP-1 蛋白的表達

  RIPA 裂解液裂解腎組織,提取細胞總蛋白,BCA 法測蛋白濃度,每孔上樣50 μg 蛋白,SDS-PAGE( 12%) 電泳分離樣品。電泳后的蛋白轉移至PVDF 膜上,室溫下封閉液封閉1 h,一抗孵育( 4 ℃) 過夜。然后用洗滌液洗膜10 min × 3 次,再將膜浸入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG( H + L) ( 1∶ 2 000) 中,室溫下孵育60 min,洗膜10 min × 3 次,ECL 發光顯色,曝光、顯影及定影,采用Image J 1. 43 軟件進行數據處理,條帶強度用集成光密度值表示。( 目的蛋白集成密度值/β-actin 集成密度值) 為目的蛋白表達強度。

  1. 9 統計學處理結果

  采用SPSS 13. 0 軟件進行分析,所有數據均以均數± 標準差( x ± s) 表示,2 組間比較,方差不齊用t' 檢驗,方差齊用非配對t 檢驗,多組比較采用單因素方差分析( ANOVA)分析。P < 0. 05 為組間差異具有統計學意義。

  2 結果

  2. 1 芝麻素對SHR 大鼠舒張壓的影響給藥前,各組SHR 大鼠舒張壓均明顯高于正常組( P< 0. 01) 。當模型組大鼠給藥治療后,在12 周內其舒張壓隨時間的延長逐漸下降,尤其在給藥第8 周后,與模型組比較,芝麻素各劑量組與卡托普利組大鼠舒張壓明顯下降( P < 0. 01) 。提示芝麻素具有一定降低SHR 大鼠血壓的作用。

  2. 2 芝麻素對SHR 大鼠生化指標的影響與正常組比較,模型組大鼠Scr、BUN、U-mAlb 及MDA含量明顯升高,SOD 水平顯著降低( P < 0. 01) 。與模型組相比,芝麻素低、高劑量組及卡托普利組Scr、BUN、U-mAlb、MDA 含量均顯著下降,SOD水平明顯提高( P < 0. 05,P < 0. 01) ,其中芝麻素高劑量組與卡托普利組效果更明顯 。提示芝麻素具有減輕SHR 大鼠腎損傷的作用,可能與其抗氧化應激作用有關。

  2. 3 芝麻素對SHR 大鼠腎臟形態學的影響正常組腎小球和腎小管結構均正常。與正常組比較,HE 結果顯示模型組大鼠腎小球系膜區基質增多,腎小管上皮細胞出現顆粒變性伴萎縮,腎間質發生纖維化伴淋巴-單核細胞浸潤; Masson 染色結果顯示腎小球系膜區與腎小管周圍出現大量藍染膠原沉積,纖維增生和間質纖維化。與模型組相比較,用藥組HE、Masson 染色均顯示腎小球系膜基質增生和腎小管上皮細胞變性明顯減少,膠原沉積和腎間質纖維化程度顯著減輕。提示芝麻素具有一定改善SHR 大鼠腎臟纖維化的作用。

  2. 4 芝麻素對SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細胞表達的影響正常組大鼠腎小管上皮細胞、基膜和腎間質中,極少表達TGF-β1、α-SMA,僅見很少量的棕黃色顆粒沉積; 模型組TGF-β1陽性細胞表達主要在腎小管上皮細胞,可見大量棕黃色顆粒沉積,α-SMA 陽性細胞表達主要在腎小管基膜及腎間質中,出現大量棕黃色顆粒沉積; 而用藥組腎小管基膜、上皮細胞及腎間質中棕黃色顆粒沉積明顯減少。半定量分析結果顯示,與正常組比較,模型組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細胞表達明顯增強( P < 0. 01) ; 而與模型組相比,芝麻素、卡托普利能不同程度地減弱大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細胞表達( P<0. 05,P < 0. 01) 。提示芝麻素具有下調SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細胞表達的作用。

  2. 5 芝麻素對SHR 大鼠腎組織TGF - β1、α-SMA 蛋白表達的影響模型組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達水平與正常組比較,顯著增加( P < 0. 01) ; 而與模型組相比,芝麻素與卡托普利能不同程度地降低SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達水平,差異具有顯著統計學意義( P < 0. 05,P < 0. 01,圖4) 。提示芝麻素可下調SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白的表達水平。

  2. 6 芝麻素對SHR 大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1 蛋白表達水平的影響與正常組比較,模型組大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1 蛋白表達水平增強,尤其是TIMP-1 表達顯著增強,MMP-9 /TIMP-1 比值明顯降低( P < 0. 01) ; 與模型組比較,芝麻素高劑量組及卡托普利組大鼠腎臟MMP-9、TIMP-1 蛋白表達水平降低,且TIMP-1 表達水平下降更顯著,MMP-9 /TIMP-1 比值明顯增大( P < 0. 05,P<0. 01) 。提示芝麻素能下調SHR 大鼠腎組織MMP-9 和TIMP-1 蛋白的過度表達,尤其下調TIMP-1 表達更為顯著,增大MMP-9 /TIMP-1 比值。


本文來源http://www.nvnqwx.com/shiyongwen/1557658.htm
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