原發(fā)性高血壓是發(fā)病率較高的常見疾病。發(fā)病率呈逐年上升趨勢，若不及時治療，可發(fā)展為慢性腎衰竭或尿毒癥而危及生命。目前，高血壓腎病機制尚不十分清楚，其主要的病理改變?yōu)槟I間質纖維化與腎小球硬化。其中腎間質纖維化是決定腎臟疾病發(fā)展和預后的重要因素，是所有原發(fā)或繼發(fā)慢性腎臟疾病進展至終末期腎衰竭的共同途徑。芝麻素( sesamin，Ses) 是從芝麻中提取出來的有效活性成分，具有調節(jié)血壓、血脂，保護與改善肝腎功能及抗腫瘤等藥理作用。本課題組前期研究已證實，Ses 具有減輕自發(fā)性高血壓大鼠腎損傷的保護作用，但深入的機制尚不清楚。本實驗以自發(fā)性高血壓大鼠( SHR) 為研究對象，探討Ses 減輕大鼠腎臟纖維化的作用及其可能存在的機制。

　　1 材料與方法

　　1. 1 藥品和試劑

　　芝麻素( 分子式C20H15O6，相對分子質量354. 34，純度≥98%) ，購自上海純優(yōu)生物科技有限公司; 卡托普利片( 批號:13030711) ，購自常州制藥廠有限公司; 丙二醛( MDA) 、超氧化物歧化酶( SOD) 、BCA( bicinchoninicacid) 蛋白濃度檢測試劑盒、α-平滑肌肌動蛋白( α-SMA，批號: AA132) 抗體均購自碧云天生物技術研究所; 轉化生長因子-β1( TGF-β1，批號:BA0290 ) 、基質金屬蛋白酶-9 ( MMP-9，批號:BA2202) 、基質金屬蛋白酶的組織抑制劑-1( TIMP-1，批號: BA3727) 抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。

　　1. 2 儀器

　　ALC-NIBP 無創(chuàng)尾動脈血壓測定分析系統(tǒng)( 上海奧爾科特生物科技有限公司) ; DYCP-34A 型電泳槽、DYY-Ⅲ-8B 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳( 北京六一儀器廠) ; Mini PROTEAN 轉膜系統(tǒng)、MiniPROTEAN 電泳系統(tǒng)( 美國Bio-Rad 公司) ; CS-15臺式離心機( Beckman Coulter) ; SIEMENS RXLMAX全自動生化儀( 上海西門子有限公司) 。

　　1. 3 實驗

　　動物及分組10 周齡雄性SHR 大鼠28 只，WKY 大鼠7 只，體質量180 ～ 200 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號為SCXK ( 滬) 2012-0002， 合格證號為2007000552035。大鼠每4 只1 籠進行飼養(yǎng)，自然光照，室溫( 23 ± 2) ℃，相對濕度60% ～ 65%，動物可自由進食飲水。SHR 大鼠適應性喂養(yǎng)3周后，隨機分為4 組: 模型( SHR) 組、芝麻素低、高( 80、160 mg /kg) 劑量組及卡托普利( 30 mg /kg)組，以同周齡WKY 大鼠作為對照組。按上述設定劑量灌胃給藥，每日一次，連續(xù)12 周。

　　1. 4 測量

　　血壓采用尾動脈無創(chuàng)測壓法。在干燥、安靜的環(huán)境中，將清醒狀態(tài)下的大鼠放置于37 ℃ 恒溫袋內預熱15 min，用ALC-NIBP 無創(chuàng)血壓計測量尾動脈舒張壓，在大鼠安靜狀態(tài)下連續(xù)測定3 次，每次間隔1 ～ 2 min，取其平均值。

　　1. 5 生化指標檢測

　　全自動生物化學分析儀測定各組大鼠血清肌酐( Scr) 、尿素氮( BUN) 和尿微量白蛋白( U-mAlb) 含量; 黃嘌呤氧化酶法測定SOD; 硫代巴比妥酸法測定MDA。具體方法、操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

　　1. 6 腎臟病理學變化

　　觀察給藥12 周后， 10%水合氯醛( 0. 33 g /kg，i . p. ) 麻醉各組大鼠，取腎臟組織，置入4%多聚甲醛溶液中固定48 h 后，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、水化等，進行HE 和Masson染色，光鏡下觀察腎臟病理學變化。

　　1. 7 免疫組織化學法測

　　TGF-β1、α-SMA 陽性細胞的表達按照厚度約為5 μm/片的標準將各組大鼠腎臟石蠟橫斷面連續(xù)切5 ～ 6 片，切片常規(guī)脫蠟至水。嚴格按照免疫組化試劑盒說明書操作。將免疫組化染色的切片在光鏡下統(tǒng)一放大10 ×40 倍，采用Image-pro plus 圖像分析軟件進行半定量分析，將每只大鼠腎組織染色切片各取5 個相同單位面積的區(qū)域，棕黃色顆粒為陽性細胞，測定TGF-β1及α-SMA 陽性細胞的積分光密度值( IOD) ，計算其平均積分光密度值( AIOD) 。

　　1. 8 Western blot 測TGF-β1、α-SMA、MMP-9、TIMP-1 蛋白的表達

　　RIPA 裂解液裂解腎組織，提取細胞總蛋白，BCA 法測蛋白濃度，每孔上樣50 μg 蛋白，SDS-PAGE( 12%) 電泳分離樣品。電泳后的蛋白轉移至PVDF 膜上，室溫下封閉液封閉1 h，一抗孵育( 4 ℃) 過夜。然后用洗滌液洗膜10 min × 3 次，再將膜浸入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG( H + L) ( 1∶ 2 000) 中，室溫下孵育60 min，洗膜10 min × 3 次，ECL 發(fā)光顯色，曝光、顯影及定影，采用Image J 1. 43 軟件進行數(shù)據(jù)處理，條帶強度用集成光密度值表示。( 目的蛋白集成密度值/β-actin 集成密度值) 為目的蛋白表達強度。

　　1. 9 統(tǒng)計學處理結果

　　采用SPSS 13. 0 軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)± 標準差( x ± s) 表示，2 組間比較，方差不齊用t' 檢驗，方差齊用非配對t 檢驗，多組比較采用單因素方差分析( ANOVA)分析。P < 0. 05 為組間差異具有統(tǒng)計學意義。

　　2 結果

　　2. 1 芝麻素對SHR 大鼠舒張壓的影響給藥前，各組SHR 大鼠舒張壓均明顯高于正常組( P< 0. 01) 。當模型組大鼠給藥治療后，在12 周內其舒張壓隨時間的延長逐漸下降，尤其在給藥第8 周后，與模型組比較，芝麻素各劑量組與卡托普利組大鼠舒張壓明顯下降( P < 0. 01) 。提示芝麻素具有一定降低SHR 大鼠血壓的作用。

　　2. 2 芝麻素對SHR 大鼠生化指標的影響與正常組比較，模型組大鼠Scr、BUN、U-mAlb 及MDA含量明顯升高，SOD 水平顯著降低( P < 0. 01) 。與模型組相比，芝麻素低、高劑量組及卡托普利組Scr、BUN、U-mAlb、MDA 含量均顯著下降，SOD水平明顯提高( P < 0. 05，P < 0. 01) ，其中芝麻素高劑量組與卡托普利組效果更明顯 。提示芝麻素具有減輕SHR 大鼠腎損傷的作用，可能與其抗氧化應激作用有關。

　　2. 3 芝麻素對SHR 大鼠腎臟形態(tài)學的影響正常組腎小球和腎小管結構均正常。與正常組比較，HE 結果顯示模型組大鼠腎小球系膜區(qū)基質增多，腎小管上皮細胞出現(xiàn)顆粒變性伴萎縮，腎間質發(fā)生纖維化伴淋巴-單核細胞浸潤; Masson 染色結果顯示腎小球系膜區(qū)與腎小管周圍出現(xiàn)大量藍染膠原沉積，纖維增生和間質纖維化。與模型組相比較，用藥組HE、Masson 染色均顯示腎小球系膜基質增生和腎小管上皮細胞變性明顯減少，膠原沉積和腎間質纖維化程度顯著減輕。提示芝麻素具有一定改善SHR 大鼠腎臟纖維化的作用。

　　2. 4 芝麻素對SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細胞表達的影響正常組大鼠腎小管上皮細胞、基膜和腎間質中，極少表達TGF-β1、α-SMA，僅見很少量的棕黃色顆粒沉積; 模型組TGF-β1陽性細胞表達主要在腎小管上皮細胞，可見大量棕黃色顆粒沉積，α-SMA 陽性細胞表達主要在腎小管基膜及腎間質中，出現(xiàn)大量棕黃色顆粒沉積; 而用藥組腎小管基膜、上皮細胞及腎間質中棕黃色顆粒沉積明顯減少。半定量分析結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細胞表達明顯增強( P < 0. 01) ; 而與模型組相比，芝麻素、卡托普利能不同程度地減弱大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細胞表達( P<0. 05，P < 0. 01) 。提示芝麻素具有下調SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細胞表達的作用。

　　2. 5 芝麻素對SHR 大鼠腎組織TGF - β1、α-SMA 蛋白表達的影響模型組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達水平與正常組比較，顯著增加( P < 0. 01) ; 而與模型組相比，芝麻素與卡托普利能不同程度地降低SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達水平，差異具有顯著統(tǒng)計學意義( P < 0. 05，P < 0. 01，圖4) 。提示芝麻素可下調SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白的表達水平。

　　2. 6 芝麻素對SHR 大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1 蛋白表達水平的影響與正常組比較，模型組大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1 蛋白表達水平增強，尤其是TIMP-1 表達顯著增強，MMP-9 /TIMP-1 比值明顯降低( P < 0. 01) ; 與模型組比較，芝麻素高劑量組及卡托普利組大鼠腎臟MMP-9、TIMP-1 蛋白表達水平降低，且TIMP-1 表達水平下降更顯著，MMP-9 /TIMP-1 比值明顯增大( P < 0. 05，P<0. 01) 。提示芝麻素能下調SHR 大鼠腎組織MMP-9 和TIMP-1 蛋白的過度表達，尤其下調TIMP-1 表達更為顯著，增大MMP-9 /TIMP-1 比值。