原發(fā)性高血壓是發(fā)病率較高的常見(jiàn)疾病。發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，若不及時(shí)治療，可發(fā)展為慢性腎衰竭或尿毒癥而危及生命。目前，高血壓腎病機(jī)制尚不十分清楚，其主要的病理改變?yōu)槟I間質(zhì)纖維化與腎小球硬化。其中腎間質(zhì)纖維化是決定腎臟疾病發(fā)展和預(yù)后的重要因素，是所有原發(fā)或繼發(fā)慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎衰竭的共同途徑。芝麻素( sesamin，Ses) 是從芝麻中提取出來(lái)的有效活性成分，具有調(diào)節(jié)血壓、血脂，保護(hù)與改善肝腎功能及抗腫瘤等藥理作用。本課題組前期研究已證實(shí)，Ses 具有減輕自發(fā)性高血壓大鼠腎損傷的保護(hù)作用，但深入的機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)以自發(fā)性高血壓大鼠( SHR) 為研究對(duì)象，探討Ses 減輕大鼠腎臟纖維化的作用及其可能存在的機(jī)制。

　　1 材料與方法

　　1. 1 藥品和試劑

　　芝麻素( 分子式C20H15O6，相對(duì)分子質(zhì)量354. 34，純度≥98%) ，購(gòu)自上海純優(yōu)生物科技有限公司; 卡托普利片( 批號(hào):13030711) ，購(gòu)自常州制藥廠有限公司; 丙二醛( MDA) 、超氧化物歧化酶( SOD) 、BCA( bicinchoninicacid) 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白( α-SMA，批號(hào): AA132) 抗體均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所; 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1( TGF-β1，批號(hào):BA0290 ) 、基質(zhì)金屬蛋白酶-9 ( MMP-9，批號(hào):BA2202) 、基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑-1( TIMP-1，批號(hào): BA3727) 抗體均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

　　1. 2 儀器

　　ALC-NIBP 無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)定分析系統(tǒng)( 上海奧爾科特生物科技有限公司) ; DYCP-34A 型電泳槽、DYY-Ⅲ-8B 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳( 北京六一儀器廠) ; Mini PROTEAN 轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、MiniPROTEAN 電泳系統(tǒng)( 美國(guó)Bio-Rad 公司) ; CS-15臺(tái)式離心機(jī)( Beckman Coulter) ; SIEMENS RXLMAX全自動(dòng)生化儀( 上海西門(mén)子有限公司) 。

　　1. 3 實(shí)驗(yàn)

　　動(dòng)物及分組10 周齡雄性SHR 大鼠28 只，WKY 大鼠7 只，體質(zhì)量180 ～ 200 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)為SCXK ( 滬) 2012-0002， 合格證號(hào)為2007000552035。大鼠每4 只1 籠進(jìn)行飼養(yǎng)，自然光照，室溫( 23 ± 2) ℃，相對(duì)濕度60% ～ 65%，動(dòng)物可自由進(jìn)食飲水。SHR 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3周后，隨機(jī)分為4 組: 模型( SHR) 組、芝麻素低、高( 80、160 mg /kg) 劑量組及卡托普利( 30 mg /kg)組，以同周齡WKY 大鼠作為對(duì)照組。按上述設(shè)定劑量灌胃給藥，每日一次，連續(xù)12 周。

　　1. 4 測(cè)量

　　血壓采用尾動(dòng)脈無(wú)創(chuàng)測(cè)壓法。在干燥、安靜的環(huán)境中，將清醒狀態(tài)下的大鼠放置于37 ℃ 恒溫袋內(nèi)預(yù)熱15 min，用ALC-NIBP 無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)測(cè)量尾動(dòng)脈舒張壓，在大鼠安靜狀態(tài)下連續(xù)測(cè)定3 次，每次間隔1 ～ 2 min，取其平均值。

　　1. 5 生化指標(biāo)檢測(cè)

　　全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀測(cè)定各組大鼠血清肌酐( Scr) 、尿素氮( BUN) 和尿微量白蛋白( U-mAlb) 含量; 黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD; 硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA。具體方法、操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

　　1. 6 腎臟病理學(xué)變化

　　觀察給藥12 周后， 10%水合氯醛( 0. 33 g /kg，i . p. ) 麻醉各組大鼠，取腎臟組織，置入4%多聚甲醛溶液中固定48 h 后，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、水化等，進(jìn)行HE 和Masson染色，光鏡下觀察腎臟病理學(xué)變化。

　　1. 7 免疫組織化學(xué)法測(cè)

　　TGF-β1、α-SMA 陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)按照厚度約為5 μm/片的標(biāo)準(zhǔn)將各組大鼠腎臟石蠟橫斷面連續(xù)切5 ～ 6 片，切片常規(guī)脫蠟至水。嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。將免疫組化染色的切片在光鏡下統(tǒng)一放大10 ×40 倍，采用Image-pro plus 圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，將每只大鼠腎組織染色切片各取5 個(gè)相同單位面積的區(qū)域，棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，測(cè)定TGF-β1及α-SMA 陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度值( IOD) ，計(jì)算其平均積分光密度值( AIOD) 。

　　1. 8 Western blot 測(cè)TGF-β1、α-SMA、MMP-9、TIMP-1 蛋白的表達(dá)

　　RIPA 裂解液裂解腎組織，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)蛋白濃度，每孔上樣50 μg 蛋白，SDS-PAGE( 12%) 電泳分離樣品。電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，室溫下封閉液封閉1 h，一抗孵育( 4 ℃) 過(guò)夜。然后用洗滌液洗膜10 min × 3 次，再將膜浸入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG( H + L) ( 1∶ 2 000) 中，室溫下孵育60 min，洗膜10 min × 3 次，ECL 發(fā)光顯色，曝光、顯影及定影，采用Image J 1. 43 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，條帶強(qiáng)度用集成光密度值表示。( 目的蛋白集成密度值/β-actin 集成密度值) 為目的蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

　　1. 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果

　　采用SPSS 13. 0 軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差( x ± s) 表示，2 組間比較，方差不齊用t' 檢驗(yàn)，方差齊用非配對(duì)t 檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析( ANOVA)分析。P < 0. 05 為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 結(jié)果

　　2. 1 芝麻素對(duì)SHR 大鼠舒張壓的影響給藥前，各組SHR 大鼠舒張壓均明顯高于正常組( P< 0. 01) 。當(dāng)模型組大鼠給藥治療后，在12 周內(nèi)其舒張壓隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，尤其在給藥第8 周后，與模型組比較，芝麻素各劑量組與卡托普利組大鼠舒張壓明顯下降( P < 0. 01) 。提示芝麻素具有一定降低SHR 大鼠血壓的作用。

　　2. 2 芝麻素對(duì)SHR 大鼠生化指標(biāo)的影響與正常組比較，模型組大鼠Scr、BUN、U-mAlb 及MDA含量明顯升高，SOD 水平顯著降低( P < 0. 01) 。與模型組相比，芝麻素低、高劑量組及卡托普利組Scr、BUN、U-mAlb、MDA 含量均顯著下降，SOD水平明顯提高( P < 0. 05，P < 0. 01) ，其中芝麻素高劑量組與卡托普利組效果更明顯 。提示芝麻素具有減輕SHR 大鼠腎損傷的作用，可能與其抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。

　　2. 3 芝麻素對(duì)SHR 大鼠腎臟形態(tài)學(xué)的影響正常組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)均正常。與正常組比較，HE 結(jié)果顯示模型組大鼠腎小球系膜區(qū)基質(zhì)增多，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)顆粒變性伴萎縮，腎間質(zhì)發(fā)生纖維化伴淋巴-單核細(xì)胞浸潤(rùn); Masson 染色結(jié)果顯示腎小球系膜區(qū)與腎小管周?chē)霈F(xiàn)大量藍(lán)染膠原沉積，纖維增生和間質(zhì)纖維化。與模型組相比較，用藥組HE、Masson 染色均顯示腎小球系膜基質(zhì)增生和腎小管上皮細(xì)胞變性明顯減少，膠原沉積和腎間質(zhì)纖維化程度顯著減輕。提示芝麻素具有一定改善SHR 大鼠腎臟纖維化的作用。

　　2. 4 芝麻素對(duì)SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的影響正常組大鼠腎小管上皮細(xì)胞、基膜和腎間質(zhì)中，極少表達(dá)TGF-β1、α-SMA，僅見(jiàn)很少量的棕黃色顆粒沉積; 模型組TGF-β1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)主要在腎小管上皮細(xì)胞，可見(jiàn)大量棕黃色顆粒沉積，α-SMA 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)主要在腎小管基膜及腎間質(zhì)中，出現(xiàn)大量棕黃色顆粒沉積; 而用藥組腎小管基膜、上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)中棕黃色顆粒沉積明顯減少。半定量分析結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增強(qiáng)( P < 0. 01) ; 而與模型組相比，芝麻素、卡托普利能不同程度地減弱大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)( P<0. 05，P < 0. 01) 。提示芝麻素具有下調(diào)SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的作用。

　　2. 5 芝麻素對(duì)SHR 大鼠腎組織TGF - β1、α-SMA 蛋白表達(dá)的影響模型組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達(dá)水平與正常組比較，顯著增加( P < 0. 01) ; 而與模型組相比，芝麻素與卡托普利能不同程度地降低SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達(dá)水平，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P < 0. 05，P < 0. 01，圖4) 。提示芝麻素可下調(diào)SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白的表達(dá)水平。

　　2. 6 芝麻素對(duì)SHR 大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1 蛋白表達(dá)水平的影響與正常組比較，模型組大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1 蛋白表達(dá)水平增強(qiáng)，尤其是TIMP-1 表達(dá)顯著增強(qiáng)，MMP-9 /TIMP-1 比值明顯降低( P < 0. 01) ; 與模型組比較，芝麻素高劑量組及卡托普利組大鼠腎臟MMP-9、TIMP-1 蛋白表達(dá)水平降低，且TIMP-1 表達(dá)水平下降更顯著，MMP-9 /TIMP-1 比值明顯增大( P < 0. 05，P<0. 01) 。提示芝麻素能下調(diào)SHR 大鼠腎組織MMP-9 和TIMP-1 蛋白的過(guò)度表達(dá)，尤其下調(diào)TIMP-1 表達(dá)更為顯著，增大MMP-9 /TIMP-1 比值。