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詳談RGD肽段連接的近紅外量子點對小鼠的毒性作用論文

實用文 時間:2021-08-31 手機版

  目前功能化的量子點(quantum dots,QDs)探針已在細胞和生物分子標記示蹤、活體腫瘤成像、藥物監測、信號轉導和生物芯片等生物醫學研究領域顯示出極其重要的作用。但由于QDs核的成分為重金屬(如Cd、Se等),其生物毒性和生物安全性引起了人們的廣泛關注。有研究表明:由于QDs核的重金屬離子釋放以及作為納米粒的QDs具有誘導細胞產生活性氧自由基,從而對機體和細胞產生毒性作用。但另外一些研究表明:一些表面包裹有生物活性物質的功能化QDs,在體外和體內均未觀察到對細胞或機體的毒性作用。已有研究證實:影響功能化QDs毒性的因素很多,包括QDs核的成分組成、粒徑大小、暴露濃度、暴露時間、表面包覆材料的物理和化學性質、作用環境、給藥途徑和作用細胞的種類等,因而不能籠統地將功能化QDs定義為有毒或無毒,對不同類型功能化的QDs的生物毒性需要進行個體化的評價,重要的是首先要評價不同類型功能化QDs在達到醫學應用目的的劑量下是無毒或有毒。近年來有研究證明:將近紅外量子點(near-infrared quantum dots,NIR QDs)與RGD連接制備的NIR QD-RGD探針能與腫瘤新生血管內皮細胞表達的整合素αvβ3特異性地靶向結合,對體質量為20~25g的小鼠,每只靜脈注射150~200pmol劑量的NIR QD-RGD探針能達到對體內腫瘤及腫瘤新生血管清楚的成像,對癌癥的早期診斷,體內腫瘤成像和個體化治療具有巨大的發展前景,但目前還未見NIR QD-RGD的毒性研究報道。用于臨床的制劑,無論診斷和治療,常常需要重復使用,因此重要的是要評價NIR QD-RGD在達到醫學應用目的所需的劑量下重復使用時其毒性作用。本研究用發射波長為800nm 的NIR QDs(NIR QD800) 與RGD 肽段偶聯,制備NIRQD800-RGD 探針,探討200pmol劑量的NIRQD800-RGD對小鼠行靜脈單次和重復注射后是否對機體和細胞產生毒性作用,為NIR QD-RGD的進一步研究和向臨床應用轉化提供依據。

詳談RGD肽段連接的近紅外量子點對小鼠的毒性作用論文

  1 材料與方法

  1.1 主要試劑和儀器

  QD800抗體連接試劑盒(Q22071MP,Invitrogen公司,美國),RGD肽段(上海吉爾生化),總蛋白定量試劑盒(A045-2)、總超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(A001)、谷胱甘肽(GSH) 測試盒(A006-1) 和丙二醛(MDA)測試盒(A003-1) (南京建成生物工程研究所)。紫外分光光度計(DU-600,Beckman公司,美國),透射電子顯微鏡(H-7500,日立公司,日本),激光光散射儀(BI-200SM,Brookhaven公司,美國),活體成像系統(Maestro EX IVIS,CRI 公司, 美國), 全自動血細胞分析儀(XE2100,Sysmex公司,日本),全自動生化分析儀(ModularDDP,Roche公司,德國),冷凍離心機(Z233MK-2,HERMLE公司,德國),光學顯微鏡(E100,尼康公司,日本)。

  1.2 實驗動物

  SPF級雄性BALB/C小鼠33只,鼠齡6~8周,體質量17~20g,購自重慶醫科大學實驗動物中心,恒溫恒濕條件下飼養,室溫(22±2)℃,空氣濕度(60±10)%,墊料、飼料和飲水均經滅菌處理,飼料和水自由攝取。所有實驗操作程序均經過重慶醫科大學實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準。

  1.3 QD800-RGD的制備

  按照QD800抗體連接試劑盒實驗手冊提供的實驗步驟制備QD800-RGD。①量子點活化和洗脫:濃度為10mmol·L-1的雙功能SMCC溶液預熱15min (37℃)后取出14μL加入1.5mL的EP管內,然后加入濃度為4μmol·L-1的QD800液125μL,均勻混合,在室溫下活化反應1h后用NAP-5柱子洗脫反應樣本,收集有色的洗脫液約500μL。②RGD的還原和分離:RGD 肽段粉劑溶于300 μL、pH 為7.2~7.4的PBS液中,調整到濃度為1g·L-1,然后將6.1μL濃度為1mol·L-1的DTT液加入RGD溶液中,混合均勻,室溫下還原反應30min后加入20μL染料指示標記液,用NAP-5柱分離反應樣本,從洗脫出的第一滴著色樣本開始收集,共收集500μL。③偶聯和滅活:將以上收集的2種洗脫液混合均勻、室溫下偶聯反應1h,然后加入濃度為10mmol·L-1的2-巰基乙醇3μL,均勻混合后在室溫下滅活反應30min。④濃縮和純化:將1mL以上偶聯滅活后的樣本加入2個超濾離心裝置管中,每個管0.5 mL,超速離心15 min(7 000r·min-1),收集各超濾離心膜內側20μL的偶聯樣本溶液,然后用Pierce柱行色譜分離,得純化的QD800-RGD。最后根據產品說明書提供的消光系數和測量波長算出純化的QD800-RGD濃度,其計算公式為:A=εcl(A 為吸光度值,ε為消光系數,c為分子濃度,l為光程)。

  1.4 QD800-RGD和QD800特性檢測

  分別各取濃度為16mmol·L-1的QD800-RGD和QD800溶液50μL,用雙蒸水稀釋100倍,超聲震蕩后分別吸取各樣品懸液約50μL滴到有膜的銅網上,靜置10min后用濾紙吸去多余的液體,待干后用透射電子顯微鏡觀察QD800-RGD和QD800的分散性。然后再分別取QD800-RGD和QD800各200μL于樣品池內,用超純水稀釋至6mL,密封樣品池后用激光光散射儀檢測QD800-RGD和QD800的流體動力學直徑。

  1.5 QD800-RGD 和QD800在小鼠體內分布

  SPF級雄性BALB/C 小鼠9只,隨機分為3組,每組3只。Ⅰ組通過尾靜脈注射100μL的QD800-RGD液(含200pmol QD800),Ⅱ組通過尾靜脈注射100μL (含200pmol)QD800,Ⅲ組通過尾靜脈注射100μL的PBS液。24h后斷頸處死小鼠,立即解剖取出腦、心、肝、脾、肺、腎、脛骨和胃,用PBS沖洗后濾紙吸干,用Maestro EXIVIS行器官的熒光成像檢測(激發光:630nm;發射光:800nm),觀察QD800-RGD和QD800在小鼠以上各器官的分布。

  1.6 各組小鼠全血細胞計數和血清生化分析

  24只SPF級雄性BALB/C小鼠隨機分成4組,每組6只。單次注射組小鼠在第1天通過尾靜脈注射100μL的QD800-RGD (含200pmol QD800);單次注射對照組小鼠在第1 天通過尾靜脈注射100μL的PBS;重復注射組小鼠分別在第1和7天通過尾靜脈各注射100μL 的QD800-RGD (含200pmol的QD800);重復注射對照組小鼠分別在第1和7天通過尾靜脈各注射100μL的PBS。每天觀察1次小鼠的一般情況。第14天,將小鼠禁食不禁水12h后摘除眼球采血,每只小鼠取血約1.2mL,分別裝入抗凝采血管和促凝采血管各約0.6mL。用全自動血細胞分析儀檢測抗凝管全血中的白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板、淋巴細胞和中性粒細胞。將促凝管中收集的血液立即離心6min (4℃、3 000r·min-1)分離得到血清,用全自動生化分析儀檢測血清中總蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比值、天門冬氨酸氨基轉換酶、丙氨酸氨基轉換酶和血尿素氮。

  1.7 各組小鼠臟器系數

  24只小鼠取血后,立即脫臼處死,稱體質量,然后解剖取出肝、脾、腎和肺,用濾紙吸干臟器表面的體液和血液后用電子天平稱質量,小鼠的臟器系數=臟器質量(g)/體質量(g)×100%。

  1.8 各組小鼠肝、脾、腎和肺組織中氧化和抗氧化指標的檢測

  24只小鼠的器官稱質量后,立即將肝、脾、腎和肺切分為2塊,將各器官的其中一塊用4℃ 生理鹽水沖洗3次,濾紙吸干后準確稱質量,按器官質量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入生理鹽水,冰水浴條件下機械勻漿3min,將勻漿液低溫離心10 min (4℃、3 000r·min-1),分別各取上清液用考馬斯亮藍法檢測各勻漿液的總蛋白濃度。然后用總SOD測試盒、GSH測試盒和MDA試劑盒分別測定肝、脾、腎和肺組織中的總SOD、GSH 活性和MDA含量,實驗嚴格按測試盒說明書進行。

  1.9 各組小鼠組織病理學檢查

  將另一塊肝、脾、腎和肺組織用4%多聚甲醛固定6h后行常規石蠟包埋,切割為4μm 厚的組織切片,HE染色后采用光學顯微鏡觀察組織病理學變化。

  1.10 統計學分析

  采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析。全血中的白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板、淋巴細胞和中性粒細胞,血清中總蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比值、天門冬氨酸氨基轉換酶、丙氨酸氨基轉換酶和血尿素氮,器官體質量系數,總SOD、GSH活性和MDA含量均以x±s表示,組間比較采用單因素方差分析。


本文來源http://www.nvnqwx.com/shiyongwen/1557634.htm
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