淺談基因工程在番茄抗旱方面的作用論文

摘要：番茄抗旱性是由許多微效基因座和數(shù)百個(gè)影響干旱形態(tài)和生理反應(yīng)的基因控制的, 闡明番茄抗旱的分子機(jī)制、開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記輔助選擇將有助于加速培育具有抗旱性的番茄新品種。本文概述了番茄抗旱分子機(jī)制的研究進(jìn)展、番茄在干旱條件下的形態(tài)特征變化和抗旱育種, 重點(diǎn)闡述了番茄抗旱性基因工程改良方面的研究進(jìn)展, 為進(jìn)一步應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行植物抗旱性基因工程改良和分子標(biāo)記輔助選擇育種提供方法和思路。

關(guān)鍵詞：番茄; 抗旱; 育種; 基因工程; 綜述;

　　中國(guó)人口眾多, 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所用的淡水資源十分匱乏, 人均僅有2 200 m3, 是全球人均淡水資源最貧乏的國(guó)家之一 (王海波, 2011) 。干旱缺水在眾多非生物脅迫中是最具破壞性的, 同時(shí)也是限制作物產(chǎn)量和品質(zhì)的一個(gè)重要影響因素 (Tuberosa&Salvi, 2006) 。其中生殖生長(zhǎng)期受干旱影響最大, 在生殖階段干旱脅迫可以直接導(dǎo)致作物的產(chǎn)量損失大于50% (Boyer, 1982) 。

　　干旱脅迫通常伴隨著熱脅迫或其他脅迫, 植物使用多種策略來(lái)響應(yīng)干旱脅迫并且通過(guò)多種信號(hào)級(jí)聯(lián)和滲透調(diào)節(jié)等形態(tài)和生理改變以適應(yīng)干旱。Levitt (1981) 認(rèn)為, 植物適應(yīng)干旱的機(jī)理可分為避旱、御旱和耐旱, 并且將御旱性和耐旱性統(tǒng)稱為抗旱性。避旱即植物在干旱來(lái)臨之前加速發(fā)芽, 縮短生命周期以避免干旱脅迫;御旱即植物在干旱初期, 脅迫尚不嚴(yán)重時(shí), 通過(guò)改變地上部和根系性狀以減少水分損失, 維持較高的水勢(shì), 以應(yīng)對(duì)干旱脅迫;耐旱即植物演變出一系列的緩解機(jī)制如積累滲透保護(hù)劑, 防止細(xì)胞內(nèi)水分散失;產(chǎn)生脅迫感應(yīng)信號(hào), 抗氧化劑和活性氧 (ROS) 清除劑;降低光合酶活性以降低光合作用等生理生化反應(yīng), 在嚴(yán)重干旱脅迫下維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。盡管已經(jīng)有一些策略能夠提高植物的抗旱性, 但由于抗旱性狀的生理和遺傳復(fù)雜性, 在改善抗旱性或開(kāi)發(fā)抗旱品種方面進(jìn)展緩慢。

　　番茄 (Solanum lycopersicum L.) 是全世界栽培最廣泛的蔬菜作物之一, 全球番茄產(chǎn)量達(dá)到1.6億t, 其中超過(guò)30%產(chǎn)自中國(guó) (聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織,同時(shí), 番茄也是植物科學(xué)研究的重要模式植物之一。番茄原產(chǎn)地在南美洲熱帶地區(qū), 屬于需水量較多的一種蔬菜作物, 環(huán)境脅迫中干旱脅迫是限制番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的主要制約因素 (柏成壽和陸幗一, 1991) 。因此選育抗旱性強(qiáng)的番茄品種是重要的育種目標(biāo)。目前, 主要通過(guò)常規(guī)育種、生物技術(shù)或兩者結(jié)合的方法改良植物的抗旱性。近年來(lái), 諸多學(xué)者圍繞著番茄抗旱性做了大量頗具價(jià)值的研究工作, 為番茄抗旱性的改良奠定了基礎(chǔ)。

1 干旱對(duì)番茄形態(tài)特征的影響

1.1 干旱對(duì)番茄根系的影響

　　根系發(fā)育直接受環(huán)境因素的影響, 擁有一個(gè)健壯的根系對(duì)于提高作物的抗旱性非常重要。最具代表性的智利番茄 (S.chilense) 生長(zhǎng)在世界上最干旱的地區(qū), 其發(fā)達(dá)的根系能夠促進(jìn)植株吸收深層土壤的水分 (Chetelat et al., 2009) 。Champoux等 (1995) 認(rèn)為, 水稻根系厚度、根系表面積、每分蘗根干質(zhì)量、最大根深度和根/莖比均與田間抗旱性呈正相關(guān)。楊再?gòu)?qiáng)等 (2016) 發(fā)現(xiàn), 在干旱脅迫時(shí)土壤中番茄的淺層根系會(huì)減少, 根系深扎、根表面積增加, 然而隨著干旱脅迫的加劇, 植物正常的生長(zhǎng)機(jī)制遭到破壞, 導(dǎo)致根長(zhǎng)、根表面積和根尖數(shù)等降低, 根系的正常生長(zhǎng)受到顯著抑制。

1.2 干旱對(duì)番茄葉片的影響

　　水分脅迫或其他逆境信號(hào)會(huì)誘導(dǎo)多種離子進(jìn)出保衛(wèi)細(xì)胞, 造成保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)成分發(fā)生變化, 從而導(dǎo)致保衛(wèi)細(xì)胞形態(tài)改變, 造成氣孔關(guān)閉、卷葉、植物的蒸騰速率降低, 與植物抗旱性有關(guān)的葉片性狀包括葉片形狀 (卷葉) 、角質(zhì)層、氣孔密度、氣孔孔徑、葉片滲透調(diào)節(jié)等。

　　Kadioglua等 (2012) 發(fā)現(xiàn), 水稻、玉米、小麥和高粱等作物的葉片適度卷曲可以改變植物葉片結(jié)構(gòu), 增強(qiáng)光合作用, 通過(guò)減少水分蒸發(fā)流失延遲衰老并增加冠層光透射。當(dāng)干旱脅迫嚴(yán)重時(shí), 通過(guò)誘導(dǎo)并加速植物葉片的衰老來(lái)減少綠葉面積, 從而減少蒸騰和水分的消耗 (安玉艷和梁宗鎖, 2012) 。但是在作物生產(chǎn)中, 干旱脅迫引起的葉片衰老, 導(dǎo)致干旱解除后作物冠層面積的減少和光合同化能力的降低, 進(jìn)而引起整株早衰并最終導(dǎo)致作物產(chǎn)量和品質(zhì)的下降 (Rivero et al., 2007) 。

　　氣孔在控制植物蒸騰失水、降低葉片表面的高溫、吸收CO2進(jìn)行光合作用以及促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面扮演著極其重要的角色 (Damour et al., 2010) 。番茄氣孔大部分集中于葉片下表皮, 葉片下表皮的.氣孔密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于上表皮;隨著土壤水分虧缺強(qiáng)度的增加, 葉片上表皮氣孔密度逐漸增大, 而下表皮氣孔密度呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì) (劉朝霞, 2016) 。潘那利番茄 (S.pennellii) 葉片表皮具有較多氣孔, 可吸收和利用空氣中的水分, 并且葉片上有豐富的蠟質(zhì), 可以降低干旱情況下的水分喪失, 對(duì)干旱脅迫具有明顯的耐受性 (Chetelat et al., 2009) 。

2 番茄抗旱性育種的研究進(jìn)展

　　種質(zhì)資源是育種的基礎(chǔ)。由于番茄是一種嚴(yán)格的自花授粉植物, 經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的馴化和選育, 番茄的遺傳背景逐漸變窄 (Rick, 1986) 。因此, 通過(guò)廣泛的育種策略豐富番茄的種質(zhì)資源對(duì)番茄育種極其重要。研究人員正努力通過(guò)常規(guī)育種技術(shù)、分子輔助育種和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等育種方法獲得抗旱性強(qiáng)的番茄品種。

2.1 番茄抗旱性基因工程改良研究進(jìn)展

　　轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠打破物種界限、克服生殖障礙, 把重要的抗旱基因整合到品種中, 能夠快速、有效地改良作物的抗旱性。植物為了適應(yīng)干旱脅迫, 進(jìn)化出多個(gè)調(diào)節(jié)不同干旱響應(yīng)基因的互作信號(hào)傳遞鏈, 這些干旱響應(yīng)基因用于產(chǎn)生在干旱條件下起作用以增強(qiáng)植物抗性的蛋白質(zhì), 如轉(zhuǎn)錄因子 (TF) 、酶、分子伴侶和其他功能性蛋白等。目前, 已經(jīng)有很多基因通過(guò)超量或抑制表達(dá)來(lái)檢測(cè)基因在植物抗旱中的作用, 并且取得了很大的進(jìn)展, 這些在抗旱中有功能的基因不但可以直接改良植物的抗旱性, 也可以開(kāi)發(fā)標(biāo)記, 為分子標(biāo)記輔助選擇 (MAS) 育種奠定基礎(chǔ)。

　　2.1.1 抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子

　　植物堿性亮氨酸拉鏈蛋白 (b ZIP) 、干旱響應(yīng)元件結(jié)合蛋白 (DREB) 、NAC和鋅指 (Zinc finger) 蛋白等編碼多種TF家族成員, 能夠提高植物抗旱性 (Yamaguchi-Shinozaki&Shinozaki, 2006;Ariel et al., 2007;Ciftci-Yilmaz&Mittler, 2008;Fang et al., 2008) , 這些TF基因的異位表達(dá)或抑制可能激活多種脅迫耐旱機(jī)制。

　　植物的b ZIP轉(zhuǎn)錄因子能通過(guò)參與脫落酸 (ABA) 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, 調(diào)控植物對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)。Orellana等 (2010) 研究Sl AREB1在番茄中的功能作用時(shí), 將Sl AREB1基因在番茄中超量表達(dá), 轉(zhuǎn)基因番茄植株顯著提高了對(duì)干旱和高鹽脅迫的耐受性, 同時(shí)大規(guī)模基因表達(dá)分析顯示Sl AREB1能夠上調(diào)與高鹽、干旱和氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)。

　　一些DREB/CBF基因在ABA獨(dú)立的干旱響應(yīng)過(guò)程中起重要作用, 并且通過(guò)分離和鑒定該家族的很多成員發(fā)現(xiàn), 它們能夠改良植物的抗旱性。首先在擬南芥中發(fā)現(xiàn)DREB (包括兩個(gè)亞類:DREB1和DREB2) 在干旱脅迫中起作用 (Liu et al., 1998) 。將擬南芥的At CBF1轉(zhuǎn)錄因子在rd29A啟動(dòng)子的控制下, 在番茄中異源表達(dá), 能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因番茄植株對(duì)干旱脅迫的耐受性, 并且植株正常生長(zhǎng) (Singh et al., 2011) 。然而Li等 (2012) 研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)SIDREB基因在番茄中超量表達(dá)時(shí), 由于合成赤霉素的關(guān)鍵基因下調(diào)表達(dá), 導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因番茄葉片擴(kuò)大和節(jié)間伸長(zhǎng)受到限制, 從而造成矮小的表型, 由此提高了轉(zhuǎn)基因番茄的抗旱性。

　　NAC由NAM、ATAF和CUC組成, 屬于植物特有的TF家族, 番茄中共有102條NAC蛋白, 這個(gè)家族的部分基因參與植株對(duì)病原體、病毒感染和環(huán)境刺激的反應(yīng) (Souer et al., 1996;Nuruzzaman et al., 2013) 。Liu等 (2014) 研究發(fā)現(xiàn), 將NAC轉(zhuǎn)錄因子Sl SRN1沉默能夠增加轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)生物脅迫的敏感性, 如因灰葡萄孢菌、丁香假單胞菌而感染疾病, 但會(huì)提高轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)氧化、高鹽、干旱脅迫的耐受性。Sl NAC4調(diào)控干旱和高鹽的相關(guān)基因表達(dá), 在番茄抗旱過(guò)程中起著很重要的作用 (Zhu et al., 2014) 。由此, NAC蛋白可以作為功能基因資源, 用于改善植物對(duì)生物和非生物脅迫的耐受性 (Nakashima et al., 2012;Puranik et al., 2012) 。

　　其他轉(zhuǎn)錄因子, 如乙烯響應(yīng)因子 (ERF) 不僅能夠促進(jìn)植物種子萌發(fā)、果實(shí)成熟、器官脫落、病原體反應(yīng)和衰老, 還能夠參與植物脅迫反應(yīng) (Narayana, 1991) ;并且其他研究還證明, ERF的TF家族參與植物脅迫反應(yīng) (Lorenzo et al., 2003) 。Klay等 (2014) 研究發(fā)現(xiàn), 屬于番茄ERF家族的轉(zhuǎn)錄因子Sl-ERF.B.3基因在干旱以及鹽分脅迫下被下調(diào)表達(dá), 但有趣的是低溫、高溫脅迫會(huì)誘導(dǎo)其表達(dá)。超量表達(dá)1個(gè)番茄的WRKY轉(zhuǎn)錄因子Sl WRKY39, 顯著提高了番茄的抗旱能力 (Sun et al., 2015) 。番茄的1個(gè)SR/CAMTA轉(zhuǎn)錄因子Sl SR1和Sl SR3L負(fù)向調(diào)控番茄的抗病能力, 但是正向調(diào)控番茄的抗旱性 (Li et al., 2014a) 。

　　2.1.2 氧化調(diào)控相關(guān)基因

　　活性氧 (ROS) 會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)和核酸的變性等, 可通過(guò)抑制ROS積累以減輕干旱脅迫, ROS的清除是由一系列酶和非酶抗氧化劑以及有機(jī)化合物完成的 (Gill&Tuteja, 2010) 。

　　過(guò)氧化氫酶 (CAT) 是一種抗氧化酶, 屬于ROS清除劑, 負(fù)責(zé)將H2O2分解成水和氧氣, 以維持植株體內(nèi)活性氧的平衡。將源自大腸桿菌的過(guò)氧化氫酶 (cat E) 基因引入番茄的葉綠體后, 轉(zhuǎn)基因株系對(duì)過(guò)氧化氫具有更高的親和性, 并且轉(zhuǎn)基因番茄中cat E基因過(guò)表達(dá)不僅能夠提高因冷脅迫或干旱脅迫而引起的氧化損傷的耐受性, 還能夠提高由除草劑百草枯引起的氧化應(yīng)激的耐受性 (Mohamed et al., 2003) 。

　　在高等植物中, 超氧化物歧化酶 (SOD) 作為抗氧化酶和ROS的清除劑, 負(fù)責(zé)催化超氧自由基產(chǎn)生的O2和H2O2。在植物細(xì)胞中根據(jù)酶的活性位點(diǎn)上具有不同的金屬 (Fe2+、Mn2+和Cu2+) , 以及它們?cè)趤喖?xì)胞定位中不同的位置 (細(xì)胞質(zhì)、線粒體、過(guò)氧化物酶體和葉綠體) , 將其分為幾種SOD異構(gòu)體 (Wang et al., 2007;Aydin et al., 2014) 。如Mn SOD基因在番茄植株中的過(guò)表達(dá)能提高對(duì)高鹽和干旱脅迫的抗性, 且降低了電解質(zhì)的滲透率, 這意味著Mn SOD能夠降低活性氧對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄的損傷 (Wang et al., 2007) 。

　　葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (G6PDH) 在戊糖磷酸途徑中首先氧化葡萄糖-6-磷酸 (G6P) , 是該反應(yīng)的限速酶, 并且能夠產(chǎn)生大量的NADPH。G6PDH活性增強(qiáng)能夠?yàn)榭寡趸到y(tǒng)提供NADPH, 以去除過(guò)量的ROS, 保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性 (Santo et al., 2012) 。G6PDH啟動(dòng)子中具有不同的ABA響應(yīng)元件, 其表達(dá)部分是由于ABA的誘導(dǎo) (Cardi et al., 2011) 。G6PDH在干旱條件下與ABA合成相關(guān)的NCED, ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子PP2C, 參與脯氨酸合成的P5CS, 參與ROS清除的抗壞血酸過(guò)氧化物酶 (APX) 等其他干旱相關(guān)基因均在番茄的應(yīng)激反應(yīng)中呈現(xiàn)顯著上調(diào)和活性增強(qiáng), 并且在干旱條件下呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)的狀態(tài) (Landi et al., 2016) 。綜上所述, 干旱誘導(dǎo)ABA合成和信號(hào)傳導(dǎo), 特異性激活A(yù)BA應(yīng)答基因, G6PDH則被特異地誘導(dǎo), 以此滿足清除系統(tǒng) (例如APX) 增加引起的增加還原劑的需求, 從而調(diào)節(jié)和穩(wěn)定ROS的增量, 進(jìn)而提高了植物的抗旱性 (Landi et al., 2016) 。

　　2.1.3 信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因

　　當(dāng)細(xì)胞壁首先感知非生物脅迫后會(huì)激活涉及不同脅迫基因的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) (Oliveira et al., 2014) 。轉(zhuǎn)錄后蛋白修飾如蛋白磷酸化/去磷酸化, 蛋白降解/修飾和第二信使的感應(yīng)如Ca2+, 它們?cè)诿{迫信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。一些TF和干旱響應(yīng)蛋白需要通過(guò)被磷酸化/去磷酸化或修飾等翻譯后調(diào)節(jié)以獲得活性, 例如編碼絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 、編碼CIPK蛋白激酶的基因、編碼鈣依賴蛋白激酶 (CDPK或CPK) 和編碼蔗糖非酵解型蛋白激酶鈣依賴蛋白激酶 (Sn RK) 等的基因都在干旱脅迫信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)途徑中起作用。MAPK在耐受脅迫相關(guān)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用 (Huang et al., 2012) 。將植物暴露于各種非生物脅迫條件下時(shí), MAPK參與ABA的調(diào)節(jié)過(guò)程 (Hirayama&Shinozaki, 2007) , Li等 (2013) 使用VIGS方法發(fā)現(xiàn)Sp MPK1、Sp MPK2和Sp MPK3基因通過(guò)影響ABA-H2O2途徑影響H2O2的產(chǎn)生和氣孔的運(yùn)動(dòng)來(lái)增強(qiáng)番茄的耐旱性。超表達(dá)Sl MPK7的轉(zhuǎn)基因番茄會(huì)積累較少的ROS、更多的脯氨酸和可溶性糖以及誘導(dǎo)脅迫響應(yīng)基因表達(dá), 提高轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)非生物脅迫的耐受性 (Yu et al., 2016) 。CIPK和CDPK是兩種類型的Ca2+-敏感蛋白激酶, 據(jù)報(bào)道Md SOS2L1 (源自蘋(píng)果的CIPK激酶) 能夠增加番茄和蘋(píng)果中抗氧化代謝物的水平 (Hu et al., 2016) 。Sn RK是廣泛存在于植物中的一類Ser/Thr類蛋白激酶, 在植物抗逆生理過(guò)程中具有重要的作用, 例如在番茄中抑制表達(dá)Sl Sn RK2.1、Sl Sn RK2.2顯著提高了轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)滲透脅迫的耐受性以及對(duì)氧化脅迫的耐受性, 番茄的耐鹽性和耐旱性明顯增強(qiáng) (Yang et al., 2015) 。