淺談基因工程在番茄抗旱方面的作用論文

摘要：番茄抗旱性是由許多微效基因座和數百個影響干旱形態和生理反應的基因控制的, 闡明番茄抗旱的分子機制、開發分子標記輔助選擇將有助于加速培育具有抗旱性的番茄新品種。本文概述了番茄抗旱分子機制的研究進展、番茄在干旱條件下的形態特征變化和抗旱育種, 重點闡述了番茄抗旱性基因工程改良方面的研究進展, 為進一步應用現代生物技術進行植物抗旱性基因工程改良和分子標記輔助選擇育種提供方法和思路。

關鍵詞：番茄; 抗旱; 育種; 基因工程; 綜述;

　　中國人口眾多, 農業生產所用的淡水資源十分匱乏, 人均僅有2 200 m3, 是全球人均淡水資源最貧乏的國家之一 (王海波, 2011) 。干旱缺水在眾多非生物脅迫中是最具破壞性的, 同時也是限制作物產量和品質的一個重要影響因素 (Tuberosa&Salvi, 2006) 。其中生殖生長期受干旱影響最大, 在生殖階段干旱脅迫可以直接導致作物的產量損失大于50% (Boyer, 1982) 。

　　干旱脅迫通常伴隨著熱脅迫或其他脅迫, 植物使用多種策略來響應干旱脅迫并且通過多種信號級聯和滲透調節等形態和生理改變以適應干旱。Levitt (1981) 認為, 植物適應干旱的機理可分為避旱、御旱和耐旱, 并且將御旱性和耐旱性統稱為抗旱性。避旱即植物在干旱來臨之前加速發芽, 縮短生命周期以避免干旱脅迫;御旱即植物在干旱初期, 脅迫尚不嚴重時, 通過改變地上部和根系性狀以減少水分損失, 維持較高的水勢, 以應對干旱脅迫;耐旱即植物演變出一系列的緩解機制如積累滲透保護劑, 防止細胞內水分散失;產生脅迫感應信號, 抗氧化劑和活性氧 (ROS) 清除劑;降低光合酶活性以降低光合作用等生理生化反應, 在嚴重干旱脅迫下維持細胞結構的穩定性。盡管已經有一些策略能夠提高植物的抗旱性, 但由于抗旱性狀的生理和遺傳復雜性, 在改善抗旱性或開發抗旱品種方面進展緩慢。

　　番茄 (Solanum lycopersicum L.) 是全世界栽培最廣泛的蔬菜作物之一, 全球番茄產量達到1.6億t, 其中超過30%產自中國 (聯合國糧農組織,同時, 番茄也是植物科學研究的重要模式植物之一。番茄原產地在南美洲熱帶地區, 屬于需水量較多的一種蔬菜作物, 環境脅迫中干旱脅迫是限制番茄產量和品質的主要制約因素 (柏成壽和陸幗一, 1991) 。因此選育抗旱性強的番茄品種是重要的育種目標。目前, 主要通過常規育種、生物技術或兩者結合的方法改良植物的抗旱性。近年來, 諸多學者圍繞著番茄抗旱性做了大量頗具價值的研究工作, 為番茄抗旱性的改良奠定了基礎。

1 干旱對番茄形態特征的影響

1.1 干旱對番茄根系的影響

　　根系發育直接受環境因素的影響, 擁有一個健壯的根系對于提高作物的抗旱性非常重要。最具代表性的智利番茄 (S.chilense) 生長在世界上最干旱的地區, 其發達的根系能夠促進植株吸收深層土壤的水分 (Chetelat et al., 2009) 。Champoux等 (1995) 認為, 水稻根系厚度、根系表面積、每分蘗根干質量、最大根深度和根/莖比均與田間抗旱性呈正相關。楊再強等 (2016) 發現, 在干旱脅迫時土壤中番茄的淺層根系會減少, 根系深扎、根表面積增加, 然而隨著干旱脅迫的加劇, 植物正常的生長機制遭到破壞, 導致根長、根表面積和根尖數等降低, 根系的正常生長受到顯著抑制。

1.2 干旱對番茄葉片的影響

　　水分脅迫或其他逆境信號會誘導多種離子進出保衛細胞, 造成保衛細胞內成分發生變化, 從而導致保衛細胞形態改變, 造成氣孔關閉、卷葉、植物的蒸騰速率降低, 與植物抗旱性有關的葉片性狀包括葉片形狀 (卷葉) 、角質層、氣孔密度、氣孔孔徑、葉片滲透調節等。

　　Kadioglua等 (2012) 發現, 水稻、玉米、小麥和高粱等作物的葉片適度卷曲可以改變植物葉片結構, 增強光合作用, 通過減少水分蒸發流失延遲衰老并增加冠層光透射。當干旱脅迫嚴重時, 通過誘導并加速植物葉片的衰老來減少綠葉面積, 從而減少蒸騰和水分的消耗 (安玉艷和梁宗鎖, 2012) 。但是在作物生產中, 干旱脅迫引起的葉片衰老, 導致干旱解除后作物冠層面積的減少和光合同化能力的降低, 進而引起整株早衰并最終導致作物產量和品質的下降 (Rivero et al., 2007) 。

　　氣孔在控制植物蒸騰失水、降低葉片表面的高溫、吸收CO2進行光合作用以及促進植物生長方面扮演著極其重要的角色 (Damour et al., 2010) 。番茄氣孔大部分集中于葉片下表皮, 葉片下表皮的.氣孔密度遠遠大于上表皮;隨著土壤水分虧缺強度的增加, 葉片上表皮氣孔密度逐漸增大, 而下表皮氣孔密度呈現先減小后增大的趨勢 (劉朝霞, 2016) 。潘那利番茄 (S.pennellii) 葉片表皮具有較多氣孔, 可吸收和利用空氣中的水分, 并且葉片上有豐富的蠟質, 可以降低干旱情況下的水分喪失, 對干旱脅迫具有明顯的耐受性 (Chetelat et al., 2009) 。

2 番茄抗旱性育種的研究進展

　　種質資源是育種的基礎。由于番茄是一種嚴格的自花授粉植物, 經過長期的馴化和選育, 番茄的遺傳背景逐漸變窄 (Rick, 1986) 。因此, 通過廣泛的育種策略豐富番茄的種質資源對番茄育種極其重要。研究人員正努力通過常規育種技術、分子輔助育種和轉基因技術等育種方法獲得抗旱性強的番茄品種。

2.1 番茄抗旱性基因工程改良研究進展

　　轉基因技術能夠打破物種界限、克服生殖障礙, 把重要的抗旱基因整合到品種中, 能夠快速、有效地改良作物的抗旱性。植物為了適應干旱脅迫, 進化出多個調節不同干旱響應基因的互作信號傳遞鏈, 這些干旱響應基因用于產生在干旱條件下起作用以增強植物抗性的蛋白質, 如轉錄因子 (TF) 、酶、分子伴侶和其他功能性蛋白等。目前, 已經有很多基因通過超量或抑制表達來檢測基因在植物抗旱中的作用, 并且取得了很大的進展, 這些在抗旱中有功能的基因不但可以直接改良植物的抗旱性, 也可以開發標記, 為分子標記輔助選擇 (MAS) 育種奠定基礎。

　　2.1.1 抗旱相關轉錄因子

　　植物堿性亮氨酸拉鏈蛋白 (b ZIP) 、干旱響應元件結合蛋白 (DREB) 、NAC和鋅指 (Zinc finger) 蛋白等編碼多種TF家族成員, 能夠提高植物抗旱性 (Yamaguchi-Shinozaki&Shinozaki, 2006;Ariel et al., 2007;Ciftci-Yilmaz&Mittler, 2008;Fang et al., 2008) , 這些TF基因的異位表達或抑制可能激活多種脅迫耐旱機制。

　　植物的b ZIP轉錄因子能通過參與脫落酸 (ABA) 信號轉導途徑, 調控植物對干旱脅迫的反應。Orellana等 (2010) 研究Sl AREB1在番茄中的功能作用時, 將Sl AREB1基因在番茄中超量表達, 轉基因番茄植株顯著提高了對干旱和高鹽脅迫的耐受性, 同時大規?；虮磉_分析顯示Sl AREB1能夠上調與高鹽、干旱和氧化應激相關基因的表達。

　　一些DREB/CBF基因在ABA獨立的干旱響應過程中起重要作用, 并且通過分離和鑒定該家族的很多成員發現, 它們能夠改良植物的抗旱性。首先在擬南芥中發現DREB (包括兩個亞類:DREB1和DREB2) 在干旱脅迫中起作用 (Liu et al., 1998) 。將擬南芥的At CBF1轉錄因子在rd29A啟動子的控制下, 在番茄中異源表達, 能夠顯著提高轉基因番茄植株對干旱脅迫的耐受性, 并且植株正常生長 (Singh et al., 2011) 。然而Li等 (2012) 研究發現, 當SIDREB基因在番茄中超量表達時, 由于合成赤霉素的關鍵基因下調表達, 導致轉基因番茄葉片擴大和節間伸長受到限制, 從而造成矮小的表型, 由此提高了轉基因番茄的抗旱性。

　　NAC由NAM、ATAF和CUC組成, 屬于植物特有的TF家族, 番茄中共有102條NAC蛋白, 這個家族的部分基因參與植株對病原體、病毒感染和環境刺激的反應 (Souer et al., 1996;Nuruzzaman et al., 2013) 。Liu等 (2014) 研究發現, 將NAC轉錄因子Sl SRN1沉默能夠增加轉基因番茄對生物脅迫的敏感性, 如因灰葡萄孢菌、丁香假單胞菌而感染疾病, 但會提高轉基因番茄對氧化、高鹽、干旱脅迫的耐受性。Sl NAC4調控干旱和高鹽的相關基因表達, 在番茄抗旱過程中起著很重要的作用 (Zhu et al., 2014) 。由此, NAC蛋白可以作為功能基因資源, 用于改善植物對生物和非生物脅迫的耐受性 (Nakashima et al., 2012;Puranik et al., 2012) 。

　　其他轉錄因子, 如乙烯響應因子 (ERF) 不僅能夠促進植物種子萌發、果實成熟、器官脫落、病原體反應和衰老, 還能夠參與植物脅迫反應 (Narayana, 1991) ;并且其他研究還證明, ERF的TF家族參與植物脅迫反應 (Lorenzo et al., 2003) 。Klay等 (2014) 研究發現, 屬于番茄ERF家族的轉錄因子Sl-ERF.B.3基因在干旱以及鹽分脅迫下被下調表達, 但有趣的是低溫、高溫脅迫會誘導其表達。超量表達1個番茄的WRKY轉錄因子Sl WRKY39, 顯著提高了番茄的抗旱能力 (Sun et al., 2015) 。番茄的1個SR/CAMTA轉錄因子Sl SR1和Sl SR3L負向調控番茄的抗病能力, 但是正向調控番茄的抗旱性 (Li et al., 2014a) 。

　　2.1.2 氧化調控相關基因

　　活性氧 (ROS) 會導致脂質過氧化、蛋白質和核酸的變性等, 可通過抑制ROS積累以減輕干旱脅迫, ROS的清除是由一系列酶和非酶抗氧化劑以及有機化合物完成的 (Gill&Tuteja, 2010) 。

　　過氧化氫酶 (CAT) 是一種抗氧化酶, 屬于ROS清除劑, 負責將H2O2分解成水和氧氣, 以維持植株體內活性氧的平衡。將源自大腸桿菌的過氧化氫酶 (cat E) 基因引入番茄的葉綠體后, 轉基因株系對過氧化氫具有更高的親和性, 并且轉基因番茄中cat E基因過表達不僅能夠提高因冷脅迫或干旱脅迫而引起的氧化損傷的耐受性, 還能夠提高由除草劑百草枯引起的氧化應激的耐受性 (Mohamed et al., 2003) 。

　　在高等植物中, 超氧化物歧化酶 (SOD) 作為抗氧化酶和ROS的清除劑, 負責催化超氧自由基產生的O2和H2O2。在植物細胞中根據酶的活性位點上具有不同的金屬 (Fe2+、Mn2+和Cu2+) , 以及它們在亞細胞定位中不同的位置 (細胞質、線粒體、過氧化物酶體和葉綠體) , 將其分為幾種SOD異構體 (Wang et al., 2007;Aydin et al., 2014) 。如Mn SOD基因在番茄植株中的過表達能提高對高鹽和干旱脅迫的抗性, 且降低了電解質的滲透率, 這意味著Mn SOD能夠降低活性氧對轉基因番茄的損傷 (Wang et al., 2007) 。

　　葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (G6PDH) 在戊糖磷酸途徑中首先氧化葡萄糖-6-磷酸 (G6P) , 是該反應的限速酶, 并且能夠產生大量的NADPH。G6PDH活性增強能夠為抗氧化系統提供NADPH, 以去除過量的ROS, 保護細胞膜的穩定性 (Santo et al., 2012) 。G6PDH啟動子中具有不同的ABA響應元件, 其表達部分是由于ABA的誘導 (Cardi et al., 2011) 。G6PDH在干旱條件下與ABA合成相關的NCED, ABA信號轉導因子PP2C, 參與脯氨酸合成的P5CS, 參與ROS清除的抗壞血酸過氧化物酶 (APX) 等其他干旱相關基因均在番茄的應激反應中呈現顯著上調和活性增強, 并且在干旱條件下呈現持續增長的狀態 (Landi et al., 2016) 。綜上所述, 干旱誘導ABA合成和信號傳導, 特異性激活ABA應答基因, G6PDH則被特異地誘導, 以此滿足清除系統 (例如APX) 增加引起的增加還原劑的需求, 從而調節和穩定ROS的增量, 進而提高了植物的抗旱性 (Landi et al., 2016) 。

　　2.1.3 信號傳導相關基因

　　當細胞壁首先感知非生物脅迫后會激活涉及不同脅迫基因的信號轉導 (Oliveira et al., 2014) 。轉錄后蛋白修飾如蛋白磷酸化/去磷酸化, 蛋白降解/修飾和第二信使的感應如Ca2+, 它們在脅迫信號傳導和調節中發揮重要作用。一些TF和干旱響應蛋白需要通過被磷酸化/去磷酸化或修飾等翻譯后調節以獲得活性, 例如編碼絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 、編碼CIPK蛋白激酶的基因、編碼鈣依賴蛋白激酶 (CDPK或CPK) 和編碼蔗糖非酵解型蛋白激酶鈣依賴蛋白激酶 (Sn RK) 等的基因都在干旱脅迫信號傳導和調節途徑中起作用。MAPK在耐受脅迫相關的信號網絡中起關鍵作用 (Huang et al., 2012) 。將植物暴露于各種非生物脅迫條件下時, MAPK參與ABA的調節過程 (Hirayama&Shinozaki, 2007) , Li等 (2013) 使用VIGS方法發現Sp MPK1、Sp MPK2和Sp MPK3基因通過影響ABA-H2O2途徑影響H2O2的產生和氣孔的運動來增強番茄的耐旱性。超表達Sl MPK7的轉基因番茄會積累較少的ROS、更多的脯氨酸和可溶性糖以及誘導脅迫響應基因表達, 提高轉基因番茄對非生物脅迫的耐受性 (Yu et al., 2016) 。CIPK和CDPK是兩種類型的Ca2+-敏感蛋白激酶, 據報道Md SOS2L1 (源自蘋果的CIPK激酶) 能夠增加番茄和蘋果中抗氧化代謝物的水平 (Hu et al., 2016) 。Sn RK是廣泛存在于植物中的一類Ser/Thr類蛋白激酶, 在植物抗逆生理過程中具有重要的作用, 例如在番茄中抑制表達Sl Sn RK2.1、Sl Sn RK2.2顯著提高了轉基因番茄對滲透脅迫的耐受性以及對氧化脅迫的耐受性, 番茄的耐鹽性和耐旱性明顯增強 (Yang et al., 2015) 。