有關(guān)工程化的神經(jīng)干細(xì)胞的研究進(jìn)展論文

　　1992年Reynolds等[1]首次從成年鼠的紋狀體和海馬中分離出能夠自我更新的多潛能細(xì)胞群落，首此提出神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs)的概念。由于神經(jīng)干細(xì)胞具備自我更新能力和多分化潛能的生物學(xué)特性，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治愈帶來(lái)了新的希望。隨著神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)的日漸成熟，并伴隨著基因工程技術(shù)飛速發(fā)展，研究者們可根據(jù)不同的科研目的，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行不同的基因工程改造，工程化的神經(jīng)干細(xì)胞隨之孕育而生。

1 工程化神經(jīng)干細(xì)胞的構(gòu)建

　　工程化神經(jīng)干細(xì)胞移植治療技術(shù)是目前治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病最具前景的治療方法之一。研究者們通過(guò)基因工程技術(shù)，將不同的目的基因片段成功構(gòu)建于脂質(zhì)體或病毒載體上，之后再將其成功導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞，這種受基因調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞比其他普通干細(xì)胞在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病上具有優(yōu)勢(shì)。目前神經(jīng)干細(xì)胞工程化的研究主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)神經(jīng)干細(xì)胞作為治療基因的載體，在其中插入不同目的基因的基礎(chǔ)片段，使神經(jīng)干細(xì)胞的功能性細(xì)化，與轉(zhuǎn)入的目的基因產(chǎn)生協(xié)同效果，達(dá)到更有效的治療效果;(2)可示蹤的神經(jīng)干細(xì)胞，通過(guò)基因工程將某些可示蹤的報(bào)告基因成功導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞中，標(biāo)記將要進(jìn)行移植的神經(jīng)干細(xì)胞，使移植后的神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)增殖、分化等過(guò)程更為有利地、直觀地觀察和研究;(3)永生化的神經(jīng)干細(xì)胞，通過(guò)基因技術(shù)的改造，阻止神經(jīng)干細(xì)胞的分化，使細(xì)胞在空間上處于未分化狀態(tài)，并使細(xì)胞體外傳代能力得到提高，永生化神經(jīng)干細(xì)胞不僅提高了移植治療的安全性及高效性，同時(shí)符合倫理道德研究，為神經(jīng)干細(xì)胞研究提供了更為寬廣的平臺(tái)。

　　1.1 基因治療的工程化神經(jīng)干細(xì)胞

　　中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病原因主要由于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中某種特定的細(xì)胞先天性發(fā)育不良、后天損傷以及退行性變甚至死亡，這些原因造成神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞難以或不能分泌功能性的細(xì)胞因子及神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)的破壞。基因治療技術(shù)開(kāi)始于20世紀(jì)70年代，經(jīng)過(guò)數(shù)十年的發(fā)展基因治療技術(shù)已經(jīng)得到長(zhǎng)足的進(jìn)步。研究者們利用基因治療技術(shù)，并整合神經(jīng)干細(xì)胞的生物特性，充分運(yùn)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，攜帶目的基因的神經(jīng)干細(xì)胞移植進(jìn)病患體內(nèi)，起到基因修復(fù)、基因置換及基因增強(qiáng)的作用，恢復(fù)因?yàn)榧膊∷斐傻募?xì)胞、組織或器官的生理功能缺陷。目前以神經(jīng)干細(xì)胞為靶細(xì)胞基因治療主要包括，一是以調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的分化功能為主，導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞的目的基因在移植體中可控制細(xì)胞向所缺失的細(xì)胞方向分化。二是以基因修復(fù)或置換為主，在基因治療過(guò)程當(dāng)中，在不涉及移植體中其他基因組的改變，矯正基因的異常序列達(dá)到治療的效果。最后是以神經(jīng)干細(xì)胞導(dǎo)入具有基因增強(qiáng)效果的目的基因，修復(fù)以破壞的神經(jīng)組織，并分泌各種細(xì)胞因子，以保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)。神經(jīng)干細(xì)胞基因治療始于治療帕金森病，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的開(kāi)端和代表，Anton等成功構(gòu)建了酪氨酸羥化酶為目的基因神經(jīng)干細(xì)胞，并將其移植進(jìn)帕金森病模型大鼠的紋狀體中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示構(gòu)建的神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)帕金森病治療效果明顯并無(wú)明顯異常表現(xiàn)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病方面，Klose等用轉(zhuǎn)染白介素-10基因的神經(jīng)干細(xì)胞治療自身免疫性腦脊髓炎，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞可作為白介素-10的穩(wěn)定載體，使白介素-10成功表達(dá)，同時(shí)調(diào)節(jié)T細(xì)胞改善疾病的病程。對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞分化、增殖方面，宋川等采用PCR、分子克隆與測(cè)序技術(shù)成功構(gòu)建CDK52pEGFP表達(dá)質(zhì)粒，后將CDK52基因片段成功轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞中，研究顯示CDK52成功表達(dá)后對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞具有明顯的促分化后神經(jīng)細(xì)胞的軸突生長(zhǎng)、形態(tài)成熟，細(xì)胞分化明顯、細(xì)胞多數(shù)為典型的神經(jīng)元樣或膠質(zhì)細(xì)胞樣。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、壞死性疾病方面，汪雷等采用NEP1-40作為靶基因，神經(jīng)干細(xì)胞作為載體細(xì)胞，在體外成功建立了能表達(dá)NEP1-40的神經(jīng)干細(xì)胞，將神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)入脊髓損傷大鼠模型并通過(guò)行為學(xué)判斷對(duì)脊髓損傷的影響，結(jié)果顯示基因修飾后的干細(xì)胞能夠進(jìn)一步提高脊髓損傷恢復(fù)效果。Kim 等應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒作載體將VEGF轉(zhuǎn)至神經(jīng)干細(xì)胞并移植到大鼠脊髓損傷部位，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞6周后神經(jīng)干細(xì)胞增殖明顯，多數(shù)分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，并且VEGF在治療中增加了脊髓損傷部位的血管密度及增強(qiáng)了神經(jīng)組織的.保護(hù)作用。在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤方面，閆超等利用慢病毒介導(dǎo)的大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(CD)和單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV7-TK)融合基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，并將神經(jīng)干細(xì)胞植入C6膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型體中，觀察發(fā)現(xiàn)植入神經(jīng)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組腫瘤體積有明顯的縮小，轉(zhuǎn)染了CK-TK 基因的神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞有抑制作用，與其他單一自殺基因相比抗腫瘤效果更佳明顯。Karen等利用神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)瘤細(xì)胞定向遷移能力且抑制腫瘤生長(zhǎng)的特性，構(gòu)建了具有胞嘧啶脫氨酶(CD)基因片段的神經(jīng)干細(xì)胞，并與5-氟胞嘧啶聯(lián)合移植入動(dòng)物模型體內(nèi)，病理結(jié)果顯示神經(jīng)干細(xì)胞核型正常且抑制腫瘤組織生長(zhǎng)效果明顯，這種聯(lián)合移植對(duì)于5-氟胞嘧啶安全性更加穩(wěn)定。中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的演變過(guò)程極為的復(fù)雜，在不同的演變過(guò)程當(dāng)中，不同的基因在其水平范圍內(nèi)起到的效果也不盡相同。基因工程改造的神經(jīng)干細(xì)胞作為治療疾病的新型技術(shù)，能整合于神經(jīng)干細(xì)胞上的目的基因主要集中在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子、腫瘤壞死因子、腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子等。目前，能夠與目的基因成功的整合成功是神經(jīng)干細(xì)胞工程化的現(xiàn)階段研究重點(diǎn)。

　　1.2 可示蹤的工程化神經(jīng)干細(xì)胞

　　在神經(jīng)干細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，干細(xì)胞在活體中所起到的效用作用是顯著的，但論其治療過(guò)程如神經(jīng)干細(xì)胞在移植體中存活、遷移、分化等情況還不盡完善，合適的示蹤劑能夠幫助研究者們?cè)跓o(wú)創(chuàng)性條件下識(shí)別及監(jiān)測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞治療的過(guò)程及機(jī)制。神經(jīng)干細(xì)胞導(dǎo)入可標(biāo)志性的基因片段，能夠很好地觀測(cè)移植后神經(jīng)干細(xì)胞治療過(guò)程的生物學(xué)變化。常用的標(biāo)志基因主要有大腸桿菌乳糖操縱子中的β-半乳糖苷酶(LacZ)、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)。研究表明逆轉(zhuǎn)錄病毒中可以插入LacZ、GFP等標(biāo)記分子，通過(guò)感染分裂期的細(xì)胞，使標(biāo)志基因得以表達(dá)，這樣就可以對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移、分化的全部過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。其中以熒光蛋白標(biāo)記GFP 應(yīng)用較多，1994年Chalfie等首次在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)了能發(fā)射綠色熒光的GFP，開(kāi)創(chuàng)了GFP研究與應(yīng)用先河。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)MRI對(duì)示蹤活體神經(jīng)干細(xì)胞的分辨能力具有較強(qiáng)的表現(xiàn)，但在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)某些疾病與正常組織的T1甚至T2弛像時(shí)間無(wú)明顯差別或差別不明顯，另外，雖然有些病變異常信號(hào)表達(dá)較高，但診斷與鑒別診斷仍較困難，這些情況下就需要應(yīng)用MR增強(qiáng)劑。超順磁性氧化鐵和超小順磁性氧化鐵可在體外標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞，這種示蹤劑具有一種獨(dú)特的性質(zhì)--超順磁性，通過(guò)其獨(dú)有的性質(zhì)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，并利用MRI顯像技術(shù)就可對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞移植治療的過(guò)程進(jìn)行全程觀測(cè)。國(guó)內(nèi)有研究表明在構(gòu)建后的帕金森大鼠模型中植入被超順磁性氧化鐵標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞，移植1周后MRI顯像上可見(jiàn)移植區(qū)的變化呈低信號(hào);10周后，移植區(qū)低信號(hào)表現(xiàn)在T2梯度回波仍可被觀察到，證明了利用示蹤劑超順磁性氧化鐵所標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞，在MRI顯像上能夠清晰地顯示出其分布和存活情況。除去以上標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞方法外，常用的標(biāo)記方法還有利用細(xì)胞核中插入DNA 雙鏈染料，非分離細(xì)胞的標(biāo)記技術(shù)，Y染色體標(biāo)記等方法。盡管在可示蹤工程化神經(jīng)干細(xì)胞上取得許多的進(jìn)展，但在無(wú)創(chuàng)性條件下利用影像學(xué)技術(shù)依舊不能很好的從細(xì)胞水平顯示神經(jīng)干細(xì)胞治療的全部過(guò)程。