有關工程化的神經干細胞的研究進展論文
1992年Reynolds等[1]首次從成年鼠的紋狀體和海馬中分離出能夠自我更新的多潛能細胞群落,首此提出神經干細胞(Neural stem cells,NSCs)的概念。由于神經干細胞具備自我更新能力和多分化潛能的生物學特性,為中樞神經系統疾病的治愈帶來了新的希望。隨著神經干細胞分離培養技術的日漸成熟,并伴隨著基因工程技術飛速發展,研究者們可根據不同的科研目的,對神經干細胞進行不同的基因工程改造,工程化的神經干細胞隨之孕育而生。
1 工程化神經干細胞的構建
工程化神經干細胞移植治療技術是目前治療中樞神經系統疾病最具前景的治療方法之一。研究者們通過基因工程技術,將不同的目的基因片段成功構建于脂質體或病毒載體上,之后再將其成功導入神經干細胞,這種受基因調控神經干細胞比其他普通干細胞在治療中樞神經系統疾病上具有優勢。目前神經干細胞工程化的研究主要表現在以下幾個方面:(1)神經干細胞作為治療基因的載體,在其中插入不同目的基因的基礎片段,使神經干細胞的功能性細化,與轉入的目的基因產生協同效果,達到更有效的治療效果;(2)可示蹤的神經干細胞,通過基因工程將某些可示蹤的報告基因成功導入神經干細胞中,標記將要進行移植的神經干細胞,使移植后的神經干細胞在體內增殖、分化等過程更為有利地、直觀地觀察和研究;(3)永生化的神經干細胞,通過基因技術的改造,阻止神經干細胞的分化,使細胞在空間上處于未分化狀態,并使細胞體外傳代能力得到提高,永生化神經干細胞不僅提高了移植治療的安全性及高效性,同時符合倫理道德研究,為神經干細胞研究提供了更為寬廣的平臺。
1.1 基因治療的工程化神經干細胞
中樞神經系統疾病發病原因主要由于在中樞神經系統中某種特定的細胞先天性發育不良、后天損傷以及退行性變甚至死亡,這些原因造成神經系統中細胞難以或不能分泌功能性的細胞因子及神經組織結構的破壞。基因治療技術開始于20世紀70年代,經過數十年的發展基因治療技術已經得到長足的進步。研究者們利用基因治療技術,并整合神經干細胞的生物特性,充分運用于中樞神經系統疾病的治療,攜帶目的基因的神經干細胞移植進病患體內,起到基因修復、基因置換及基因增強的作用,恢復因為疾病所造成的細胞、組織或器官的生理功能缺陷。目前以神經干細胞為靶細胞基因治療主要包括,一是以調控神經干細胞的分化功能為主,導入神經干細胞的目的基因在移植體中可控制細胞向所缺失的細胞方向分化。二是以基因修復或置換為主,在基因治療過程當中,在不涉及移植體中其他基因組的改變,矯正基因的異常序列達到治療的效果。最后是以神經干細胞導入具有基因增強效果的目的基因,修復以破壞的神經組織,并分泌各種細胞因子,以保護神經系統。神經干細胞基因治療始于治療帕金森病,是中樞神經系統疾病基因治療的開端和代表,Anton等成功構建了酪氨酸羥化酶為目的基因神經干細胞,并將其移植進帕金森病模型大鼠的紋狀體中,實驗結果顯示構建的神經干細胞對帕金森病治療效果明顯并無明顯異常表現。在中樞神經系統自身免疫性疾病方面,Klose等用轉染白介素-10基因的神經干細胞治療自身免疫性腦脊髓炎,發現神經干細胞可作為白介素-10的穩定載體,使白介素-10成功表達,同時調節T細胞改善疾病的病程。對于神經干細胞分化、增殖方面,宋川等采用PCR、分子克隆與測序技術成功構建CDK52pEGFP表達質粒,后將CDK52基因片段成功轉染入體外培養的神經干細胞中,研究顯示CDK52成功表達后對神經干細胞具有明顯的促分化后神經細胞的軸突生長、形態成熟,細胞分化明顯、細胞多數為典型的神經元樣或膠質細胞樣。在中樞神經系統損傷、壞死性疾病方面,汪雷等采用NEP1-40作為靶基因,神經干細胞作為載體細胞,在體外成功建立了能表達NEP1-40的神經干細胞,將神經干細胞轉入脊髓損傷大鼠模型并通過行為學判斷對脊髓損傷的影響,結果顯示基因修飾后的干細胞能夠進一步提高脊髓損傷恢復效果。Kim 等應用逆轉錄病毒作載體將VEGF轉至神經干細胞并移植到大鼠脊髓損傷部位,發現轉染細胞6周后神經干細胞增殖明顯,多數分化為成熟的少突膠質細胞,并且VEGF在治療中增加了脊髓損傷部位的血管密度及增強了神經組織的.保護作用。在神經系統腫瘤方面,閆超等利用慢病毒介導的大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(CD)和單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV7-TK)融合基因轉染神經干細胞,并將神經干細胞植入C6膠質瘤動物模型體中,觀察發現植入神經干細胞的實驗組較對照組腫瘤體積有明顯的縮小,轉染了CK-TK 基因的神經干細胞對膠質瘤細胞有抑制作用,與其他單一自殺基因相比抗腫瘤效果更佳明顯。Karen等利用神經干細胞向膠質瘤細胞定向遷移能力且抑制腫瘤生長的特性,構建了具有胞嘧啶脫氨酶(CD)基因片段的神經干細胞,并與5-氟胞嘧啶聯合移植入動物模型體內,病理結果顯示神經干細胞核型正常且抑制腫瘤組織生長效果明顯,這種聯合移植對于5-氟胞嘧啶安全性更加穩定。中樞神經系統發育的演變過程極為的復雜,在不同的演變過程當中,不同的基因在其水平范圍內起到的效果也不盡相同。基因工程改造的神經干細胞作為治療疾病的新型技術,能整合于神經干細胞上的目的基因主要集中在細胞周期調節因子、腫瘤壞死因子、腫瘤信號轉導因子等。目前,能夠與目的基因成功的整合成功是神經干細胞工程化的現階段研究重點。
1.2 可示蹤的工程化神經干細胞
在神經干細胞移植治療中樞神經系統疾病中,干細胞在活體中所起到的效用作用是顯著的,但論其治療過程如神經干細胞在移植體中存活、遷移、分化等情況還不盡完善,合適的示蹤劑能夠幫助研究者們在無創性條件下識別及監測神經干細胞治療的過程及機制。神經干細胞導入可標志性的基因片段,能夠很好地觀測移植后神經干細胞治療過程的生物學變化。常用的標志基因主要有大腸桿菌乳糖操縱子中的β-半乳糖苷酶(LacZ)、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、紅色熒光蛋白(red fluorescent protein,RFP)。研究表明逆轉錄病毒中可以插入LacZ、GFP等標記分子,通過感染分裂期的細胞,使標志基因得以表達,這樣就可以對神經干細胞的增殖、遷移、分化的全部過程進行監測。其中以熒光蛋白標記GFP 應用較多,1994年Chalfie等首次在大腸桿菌細胞中表達了能發射綠色熒光的GFP,開創了GFP研究與應用先河。近年來,研究發現MRI對示蹤活體神經干細胞的分辨能力具有較強的表現,但在實際工作中發現某些疾病與正常組織的T1甚至T2弛像時間無明顯差別或差別不明顯,另外,雖然有些病變異常信號表達較高,但診斷與鑒別診斷仍較困難,這些情況下就需要應用MR增強劑。超順磁性氧化鐵和超小順磁性氧化鐵可在體外標記神經干細胞,這種示蹤劑具有一種獨特的性質--超順磁性,通過其獨有的性質對神經干細胞進行標記,并利用MRI顯像技術就可對神經干細胞移植治療的過程進行全程觀測。國內有研究表明在構建后的帕金森大鼠模型中植入被超順磁性氧化鐵標記的神經干細胞,移植1周后MRI顯像上可見移植區的變化呈低信號;10周后,移植區低信號表現在T2梯度回波仍可被觀察到,證明了利用示蹤劑超順磁性氧化鐵所標記的神經干細胞,在MRI顯像上能夠清晰地顯示出其分布和存活情況。除去以上標記神經干細胞方法外,常用的標記方法還有利用細胞核中插入DNA 雙鏈染料,非分離細胞的標記技術,Y染色體標記等方法。盡管在可示蹤工程化神經干細胞上取得許多的進展,但在無創性條件下利用影像學技術依舊不能很好的從細胞水平顯示神經干細胞治療的全部過程。
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