克隆原指以幼苗或嫩枝插條，以無性繁殖或營養(yǎng)繁殖的方式培育植物，如扦插和嫁接。下面是小編為大家精心推薦的克隆生物技術(shù)論文，希望能夠?qū)δ兴鶐椭?/p>
豬USF1基因克隆與序列分析
摘要：研究克隆了豬USF1基因1 382 bp的cDNA序列(登錄號：EF 219407)和5 516 bp的DNA序列(登錄號：EF 625885)。序列分析發(fā)現(xiàn)豬USF1基因編碼區(qū)序列與人、小鼠的同源性分別為99%和98%?；蚪M序列分析發(fā)現(xiàn)豬USF1基因包含11個外顯子和10個內(nèi)含子，內(nèi)含子的剪接方式均符合“GT-AG”法則。
關(guān)鍵詞：豬;USF1基因;克隆;序列分析
中圖分類號：S828;Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114(2013)24-6175-03
上游刺激因子1(Upstream stimulatory factor 1，USF1)是螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈(HLH- LZIP)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一[1]，可以與USF2形成二聚體，并能識別DNA的E-box序列，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[2]。人類USF1基因位于1q22-q23[3]，并廣泛表達(dá)于機(jī)體的各個組織，調(diào)控糖和脂肪代謝基因的表達(dá)[4]，此外USF1基因還具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和細(xì)胞周期的功能[5]。研究發(fā)現(xiàn)USF1基因可以作為調(diào)節(jié)治療人的胰島素抵抗葡萄糖不耐癥、II型糖尿病和向心型肥胖易感癥的候選基因[6-9]。本研究利用EST信息和測序的方法克隆了豬USF1基因并進(jìn)行了序列分析，為進(jìn)一步研究該基因?qū)ωi生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)理具有重要的意義。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
采集4月齡大白豬(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所原種豬場)的肌肉組織，用液氮速凍置于
-70 ℃中，利用TRizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA，貯存于-20 ℃。
pMD-18T vector system、DH5α購自寶生物工程(大連)有限公司;Gel Extraction Kit購自生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.2 引物設(shè)計(jì)
以人的基因序列為探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索同源序列，篩選豬的同源性EST(標(biāo)準(zhǔn)：長度≥200 bp，相似性≥80%)，用DNAStar軟件包中的SeqMan程序進(jìn)行EST序列拼接，參照拼接的contig(重疊群)采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物U1F/U1R，U2F/U2R，U3F/U3R等3對引物擴(kuò)增USF1基因的cDNA序列。參照USF1基因的cDNA序列設(shè)計(jì)U4F/U4R，U5F/U5R，U6F/U6R，U7F/U7R，U8F/U8R，U9F/U9R等6對引物(表1)擴(kuò)增USF1基因的.序列。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.3 PCR擴(kuò)增與測序
PCR擴(kuò)增體系為25 μL，包括50 ng 模板DNA、2.5 mmol/L 1×Taq Buffer、1.5 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTPs、0.5 mmol/L PCR primers、2 U Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min; 94 ℃變性45 s，退火(溫度、時間根據(jù)引物來確定)，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Gel Extraction Kit試劑盒純化回收，與pMD-18T vector system連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將陽性克隆送至北京奧科生物技術(shù)有限公司測序。
2 結(jié)果與分析
2.1 RT-PCR擴(kuò)增USF1基因
以大白豬cDNA為模版，利用引物U1F/U1R，U2F/U2R，U3F/U3R均擴(kuò)增出了特異帶，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果如圖1所示。將PCR產(chǎn)物回收、純化、克隆測序，測序結(jié)果顯示引物U1F/U1R擴(kuò)增產(chǎn)物長度為613 bp(圖1a)，引物U2F/U2R擴(kuò)增產(chǎn)物長度為312 bp(圖1b)，引物U3F/U3R擴(kuò)增產(chǎn)物長度為520 bp(圖1c)。
2.2 豬USF1基因的cDNA序列同源性分析
利用DNAStar軟件的SeqMan程序?qū)T-PCR擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行拼接，得到一條長1 382 bp的 cDNA序列。將獲得的豬USF1基因的cDNA序列分別與人USF1基因cDNA序列(NM_007122)和小鼠序列(NM_009480)進(jìn)行比對。結(jié)果表明，豬與人、小鼠的同源性分別為99%和98%，確定所獲取的序列為豬的USF1基因，提交到GenBank，得到登錄號為EF 219407。
2.3 豬USF1與部分物種USF1的進(jìn)化關(guān)系
利用GenBank已有的USF1蛋白質(zhì)序列： NP_001001161(USF1，Cattle)，NP_001007486(USF1， Gallus)，NP_009053(USF1，Human)，NP_033506 (USF1， Mouse)， NP_113965(USF1，Rat)以及豬USF1基因編碼的氨基酸序列， 利用ClustalW軟件對6個物種的USF1氨基酸序列進(jìn)行了序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬與人和牛的同源性達(dá)到了99%，與小鼠和大鼠的同源性達(dá)到了98%，并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。
2.4 豬USF1基因組序列的克隆和序列分析
根據(jù)人的cDNA序列和人的基因組序列比對結(jié)果，預(yù)測的豬USF1基因內(nèi)含子，參照分離得到的基因序列，設(shè)計(jì)U4F/U4R，U5F/U5R，U6F/U6R，U7F/U7R，U8F/U8R和U9F/U9R等6對引物，以大白豬基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增豬USF1基因的10個內(nèi)含子序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測結(jié)果如圖3。
引物U4F/U4R在豬基因組中的擴(kuò)增片段長度是2 094 bp，其中第1內(nèi)含子的長度為2 007 bp;引物U5F/U5R在豬基因組中的擴(kuò)增片段長度740 bp，其中第2，3內(nèi)含子的長度分別為363 bp和157 bp;引物U6F/U6R在豬基因組中的擴(kuò)增片段長度783 bp，其中第4，5內(nèi)含子的長度分別為301 bp和241 bp;引物U7F/U7R在豬基因組中的擴(kuò)增片段長度600 bp，其中第6，7內(nèi)含子的長度分別為249 bp和135 bp;引物U8F/U8R在豬基因組中的擴(kuò)增片段長度656 bp，其中第8，9內(nèi)含子的長度分別為153 bp和249 bp;引物U9F/U9R在豬基因組中的擴(kuò)增片段長度690 bp，其中第10內(nèi)含子的長度為192 bp。利用DNAStar軟件的SeqMan程序?qū)U(kuò)增得到的片段進(jìn)行拼接，得到一條5 516 bp的DNA序列，將序列拼接提交到GenBank收錄號為EF 625885。基因組序列分析發(fā)現(xiàn)豬USF1基因包含11個外顯子和10個內(nèi)含子，內(nèi)含子的剪接方式都符合“GT-AG”法則。 3 小結(jié)與討論
本研究中豬USF1基因的cDNA序列與人和小鼠的同源性分別為99%和98%;編碼區(qū)的高度保守性證實(shí)了所分離基因的正確性，同時也為利用小鼠等模式動物的基因信息來進(jìn)行畜禽基因組學(xué)的研究提供依據(jù)。
脊椎動物間的基因序列具有高度的保守性，根據(jù)已知物種的基因組序列，可以預(yù)測其他物種同源基因的基因序列。本研究利用人USF1基因序列，預(yù)測了豬USF1基因序列，并通過試驗(yàn)獲得了相應(yīng)的基因組序列。測序結(jié)果表明，所獲得的候選基因的內(nèi)含子和外顯子組成及相對位置與預(yù)測結(jié)果一致，且內(nèi)含子的剪接方式均符合“GT-AG”法則。
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