再灌注治療能快速打開(kāi)堵塞血管、恢復(fù)冠脈血供，是治療冠心病急性心肌梗死的重要手段，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)2013 年冠狀動(dòng)脈經(jīng)皮介入術(shù)( percutaneouscoronary intervention，PCI) 的病例數(shù)超過(guò)40 萬(wàn)例，位居世界第2 位。但再灌注治療只是一種局部治療，并不能終止冠心病的病理發(fā)展進(jìn)程，加之治療后出現(xiàn)的一系列心肌缺血再灌注損傷( myocardialischemia reperfusion injury，MIRI) ，嚴(yán)重制約了冠心病的治療效果。有研究證實(shí)，急性心肌梗死( acutemyocardial infarction，AMI) 患者即使接受最佳的再灌注治療，仍有10% ～ 30%出現(xiàn)MIRI，MIRI 被認(rèn)為是導(dǎo)致心梗后心力衰竭發(fā)生率高達(dá)25% 及年死亡率達(dá)10% 的主要原因，因此防治MIRI 是臨床亟需解決的問(wèn)題。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙、脂質(zhì)氧化損傷、炎癥反應(yīng)、鈣超載及能量代謝等在MIRI的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

　　MIRI 目前臨床尚缺乏有效的干預(yù)藥物，中醫(yī)藥具有作用通路廣泛、作用靶點(diǎn)多樣的特點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。丹蔞片是痰瘀同治的上市藥物，臨床用于治療各類(lèi)冠心病心絞痛，臨床療效良好，目前關(guān)于丹蔞片的實(shí)驗(yàn)研究大都針對(duì)心肌梗死后對(duì)心臟的保護(hù)作用，而對(duì)MIRI 后心臟保護(hù)作用的研究鮮有報(bào)道。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，丹蔞片能降低大鼠心肌缺血程度，增加離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道相關(guān)酶活性，減少短暫心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的致命性及非致命性室顫發(fā)生率、室性心動(dòng)過(guò)速及室性早搏的發(fā)生頻率及持續(xù)時(shí)間。在此基礎(chǔ)上，為闡明丹蔞片對(duì)已有心肌不可逆壞死的心肌缺血再灌注治療后的心臟保護(hù)作用，本研究觀察其對(duì)大鼠心肌壞死程度及心臟射血分?jǐn)?shù)的影響，并從內(nèi)皮功能保護(hù)、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化及細(xì)胞凋亡方面探討其作用機(jī)制，為擴(kuò)大丹蔞片的臨床應(yīng)用范圍提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

　　1. 1 動(dòng)物清潔級(jí)雄性健康Wistar 大鼠80 只，體重( 300 ± 20) g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK( 京) 2012-0001，在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院動(dòng)物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

　　1. 2 藥品及試劑丹蔞片( 吉林康乃爾藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20050244) ; 羧甲基纖維素鈉，2，3，5-氯化三苯基四氮唑( TTC) ，伊文思藍(lán)，水合氯醛( 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)分別為20081023，20140507，20140228，20130201) ; 乳酸脫氫酶( LDH) 試劑盒，肌酸激酶同工酶( CK-MB) 試劑盒( 貝克曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，批號(hào)分別為AUZ1443，OSR61155) ; 大鼠內(nèi)皮素( ET) 試劑盒( 北京北方生物技術(shù)研究所，批號(hào)S20083014) ; 大鼠一氧化氮( NO) ，丙二醛( MDA) 及髓過(guò)氧化物酶( MPO) 試劑盒( 南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為A012，A003-1，A044 ) ; Protease inhibitorcocktail( Roche 公司，批號(hào)11684817910) ; 蛋白免疫印跡法( Western blot) 抗體含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶( Caspase) -3，B 細(xì)胞淋巴瘤-2( Bcl-2) 及Bcl-2相關(guān)X 蛋白( Bax) ( CST 公司，批號(hào)分別為12768，2772， 2870) ; β-肌動(dòng)蛋白( β-actin) 抗體( 中杉金橋公司，批號(hào)TA-09 ) ; DNA 斷裂的原位末端標(biāo)記法( TUNEL) 反應(yīng)液( Roche 公司，貨號(hào)11684817910) 。

　　1. 3 主要儀器RM6240BD 型多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，HX-300 型小動(dòng)物呼吸機(jī)( 成都泰萌科技有限公司) ; Pro Sound 5000 SSD-SV B 型超聲儀( 日本Aloka 株式會(huì)社ALOKA 醫(yī)用儀器有限公司) ; AU640 型全自動(dòng)生化分析儀( 美國(guó)Olympus 公司) ; Image Pro Plus 6. 0 圖像分析系統(tǒng)軟件( 美國(guó)Media Cybernetics 公司) ; UV-2000 型紫外分光光度計(jì)( 上海尤尼柯公司) ; TGL-16 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)( 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司) ; SPR-960 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀( 美國(guó)Thermo 科技公司) ; VE186 型小型高通量垂直電泳槽VE180 及轉(zhuǎn)移電泳槽( 上海天能公司) 。

2 方法

　　2. 1 分組及給藥大鼠按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、丹蔞片組，假手術(shù)組22 只，模型組30 只，丹蔞片組28 只，預(yù)防性給藥7 d，然后進(jìn)行造模手術(shù)。其中假手術(shù)及模型組均以0. 5%的羧甲基纖維素鈉灌胃，根據(jù)文獻(xiàn)丹蔞片給藥劑量選擇0. 9 g·kg - 1，丹蔞片研碎后溶于0. 5%羧甲基纖維素鈉制成混懸液，灌胃體積為10 mL·kg - 1。

　　2. 2 模型建立以10% 水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)口腔行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸頻率約70 次/min，潮氣量7 ～ 8 mL，呼吸比1 ∶ 3，連接多通道生理信號(hào)采集系統(tǒng)，描記術(shù)前Ⅱ?qū)?lián)心電圖。于左側(cè)第3 或第3 肋間切口，鈍性分離皮下組織及肌肉，打開(kāi)心包膜，在左心耳下緣距肺動(dòng)脈弓根部2 mm處結(jié)扎( 3 /8 圓針) ，進(jìn)針深度約1 mm，寬度約2 mm，在冠脈前降支面置硅膠管連同冠脈用4 號(hào)醫(yī)用縫合線(xiàn)一起結(jié)扎。50 min 后，剪去結(jié)扎線(xiàn)，連同硅膠管一同取出，進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組只在相應(yīng)部位穿線(xiàn)不結(jié)扎。關(guān)閉胸腔，逐層縫合肌肉、皮膚，術(shù)后腹腔注射青霉素10 萬(wàn)單位預(yù)防感染。結(jié)扎成功標(biāo)志: 結(jié)扎下方心肌顏色變灰白，同時(shí)心電圖ST 段進(jìn)行性抬高甚至弓背向上( 較正常至少抬高2 mm) 。復(fù)灌成功標(biāo)志: 心臟顏色由灰白逐漸恢復(fù)正常，或30 min 內(nèi)心電圖ST 下降至少50%。造模前心率<350 次/min 者，未到規(guī)定時(shí)間死亡者及造模不成功者予以剔除。

　　2. 3 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)

　　2. 3. 1 再灌注2 h 心肌酶、內(nèi)皮功能檢測(cè)每組取6 只大鼠，采集血清，以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)LDH及CK-MB，以放射免疫法檢測(cè)血清ET-1，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)血清NO 水平，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)心肌MDA，MPO 水平。

　　2. 3. 2 心肌梗死面積測(cè)定未取血大鼠于再灌注48 h 時(shí)處死，術(shù)前與取材前B 超檢測(cè)心臟射血分?jǐn)?shù)，從大鼠左肺靜脈注射0. 5%依文思藍(lán)約1. 5 mL，待大鼠口唇爪甲變藍(lán)后摘取心臟，以冰鹽水沖洗，擦干，置于- 20 ℃凍存20 min 后，沿結(jié)扎線(xiàn)以下切成等厚的4 ～ 5 片，放入1% TTC 溶液中，37 ℃ 孵育15 ～ 20 min，流水沖洗。非缺血區(qū)呈藍(lán)色，缺血未梗死區(qū)呈磚紅色，缺血區(qū)( area at risk，AAR) 為灰白區(qū)與磚紅色區(qū)域之和，梗死區(qū)( area of necrosis，AN) 呈灰白色，放置于10%甲醛中室溫固定24 h。然后用L2035AW Pioneer 數(shù)碼照相機(jī)進(jìn)行圖像采集，以Version 6. 0 Media Cybernetics Image-Pro Plus 圖像分析軟件分別計(jì)算出梗死區(qū)、占缺血區(qū)面積的比例，缺血區(qū)占左室面積的比例。

　　2. 3. 3 Western blot 法檢測(cè)心肌Caspase-3，Bax 及Bcl-2 蛋白表達(dá)每組取6 只大鼠分別檢測(cè)心肌Caspase-3，Bax 及Bcl-2 蛋白表達(dá)。根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)提取蛋白，BCA 法檢測(cè)組織蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，上樣，根據(jù)蛋白目的分子量設(shè)定電泳條件，轉(zhuǎn)膜，封閉，經(jīng)一抗( 1 ∶ 1 000) ，二抗孵育，顯色曝光，將顯色后的圖片掃描后，使用Gel Image system ver. 4. 00軟件( 上海天能科技有限公司) 對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。以目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

　　2. 3. 4 TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡每組取6 只大鼠做心臟石蠟切片，脫水，蛋白酶K 中孵育后避光條件下加稀釋液，TUNEL 反應(yīng)液，37 ℃放置1 h 轉(zhuǎn)化converter-POD( POD) ，37 ℃ 烤箱中放置30 min，取出沖洗后加DAB，經(jīng)蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯溶液透明，封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察，其中正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)出深淺不一的棕褐色。每張切片于凋亡細(xì)胞分布相同區(qū)域隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野，計(jì)算平均每個(gè)視野中的凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，即為凋亡指數(shù)。

　　2. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　采用SPSS 17. 0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料結(jié)果以珋x ± s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，P < 0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。