再灌注治療能快速打開堵塞血管、恢復(fù)冠脈血供，是治療冠心病急性心肌梗死的重要手段，據(jù)統(tǒng)計我國2013 年冠狀動脈經(jīng)皮介入術(shù)( percutaneouscoronary intervention，PCI) 的病例數(shù)超過40 萬例，位居世界第2 位。但再灌注治療只是一種局部治療，并不能終止冠心病的病理發(fā)展進(jìn)程，加之治療后出現(xiàn)的一系列心肌缺血再灌注損傷( myocardialischemia reperfusion injury，MIRI) ，嚴(yán)重制約了冠心病的治療效果。有研究證實，急性心肌梗死( acutemyocardial infarction，AMI) 患者即使接受最佳的再灌注治療，仍有10% ～ 30%出現(xiàn)MIRI，MIRI 被認(rèn)為是導(dǎo)致心梗后心力衰竭發(fā)生率高達(dá)25% 及年死亡率達(dá)10% 的主要原因，因此防治MIRI 是臨床亟需解決的問題。動物實驗發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙、脂質(zhì)氧化損傷、炎癥反應(yīng)、鈣超載及能量代謝等在MIRI的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

　　MIRI 目前臨床尚缺乏有效的干預(yù)藥物，中醫(yī)藥具有作用通路廣泛、作用靶點多樣的特點，在臨床應(yīng)用中具有獨(dú)到的優(yōu)勢。丹蔞片是痰瘀同治的上市藥物，臨床用于治療各類冠心病心絞痛，臨床療效良好，目前關(guān)于丹蔞片的實驗研究大都針對心肌梗死后對心臟的保護(hù)作用，而對MIRI 后心臟保護(hù)作用的研究鮮有報道。課題組前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，丹蔞片能降低大鼠心肌缺血程度，增加離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道相關(guān)酶活性，減少短暫心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的致命性及非致命性室顫發(fā)生率、室性心動過速及室性早搏的發(fā)生頻率及持續(xù)時間。在此基礎(chǔ)上，為闡明丹蔞片對已有心肌不可逆壞死的心肌缺血再灌注治療后的心臟保護(hù)作用，本研究觀察其對大鼠心肌壞死程度及心臟射血分?jǐn)?shù)的影響，并從內(nèi)皮功能保護(hù)、抑制脂質(zhì)過氧化及細(xì)胞凋亡方面探討其作用機(jī)制，為擴(kuò)大丹蔞片的臨床應(yīng)用范圍提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

　　1. 1 動物清潔級雄性健康Wistar 大鼠80 只，體重( 300 ± 20) g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK( 京) 2012-0001，在中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院動物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

　　1. 2 藥品及試劑丹蔞片( 吉林康乃爾藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20050244) ; 羧甲基纖維素鈉，2，3，5-氯化三苯基四氮唑( TTC) ，伊文思藍(lán)，水合氯醛( 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號分別為20081023，20140507，20140228，20130201) ; 乳酸脫氫酶( LDH) 試劑盒，肌酸激酶同工酶( CK-MB) 試劑盒( 貝克曼庫爾特實驗系統(tǒng)有限公司，批號分別為AUZ1443，OSR61155) ; 大鼠內(nèi)皮素( ET) 試劑盒( 北京北方生物技術(shù)研究所，批號S20083014) ; 大鼠一氧化氮( NO) ，丙二醛( MDA) 及髓過氧化物酶( MPO) 試劑盒( 南京建成生物工程研究所，批號分別為A012，A003-1，A044 ) ; Protease inhibitorcocktail( Roche 公司，批號11684817910) ; 蛋白免疫印跡法( Western blot) 抗體含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶( Caspase) -3，B 細(xì)胞淋巴瘤-2( Bcl-2) 及Bcl-2相關(guān)X 蛋白( Bax) ( CST 公司，批號分別為12768，2772， 2870) ; β-肌動蛋白( β-actin) 抗體( 中杉金橋公司，批號TA-09 ) ; DNA 斷裂的原位末端標(biāo)記法( TUNEL) 反應(yīng)液( Roche 公司，貨號11684817910) 。

　　1. 3 主要儀器RM6240BD 型多通道生理信號采集處理系統(tǒng)，HX-300 型小動物呼吸機(jī)( 成都泰萌科技有限公司) ; Pro Sound 5000 SSD-SV B 型超聲儀( 日本Aloka 株式會社ALOKA 醫(yī)用儀器有限公司) ; AU640 型全自動生化分析儀( 美國Olympus 公司) ; Image Pro Plus 6. 0 圖像分析系統(tǒng)軟件( 美國Media Cybernetics 公司) ; UV-2000 型紫外分光光度計( 上海尤尼柯公司) ; TGL-16 型臺式高速冷凍離心機(jī)( 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司) ; SPR-960 型全自動酶標(biāo)儀( 美國Thermo 科技公司) ; VE186 型小型高通量垂直電泳槽VE180 及轉(zhuǎn)移電泳槽( 上海天能公司) 。

2 方法

　　2. 1 分組及給藥大鼠按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、丹蔞片組，假手術(shù)組22 只，模型組30 只，丹蔞片組28 只，預(yù)防性給藥7 d，然后進(jìn)行造模手術(shù)。其中假手術(shù)及模型組均以0. 5%的羧甲基纖維素鈉灌胃，根據(jù)文獻(xiàn)丹蔞片給藥劑量選擇0. 9 g·kg - 1，丹蔞片研碎后溶于0. 5%羧甲基纖維素鈉制成混懸液，灌胃體積為10 mL·kg - 1。

　　2. 2 模型建立以10% 水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)口腔行氣管插管，連接小動物呼吸機(jī)，呼吸頻率約70 次/min，潮氣量7 ～ 8 mL，呼吸比1 ∶ 3，連接多通道生理信號采集系統(tǒng)，描記術(shù)前Ⅱ?qū)?lián)心電圖。于左側(cè)第3 或第3 肋間切口，鈍性分離皮下組織及肌肉，打開心包膜，在左心耳下緣距肺動脈弓根部2 mm處結(jié)扎( 3 /8 圓針) ，進(jìn)針深度約1 mm，寬度約2 mm，在冠脈前降支面置硅膠管連同冠脈用4 號醫(yī)用縫合線一起結(jié)扎。50 min 后，剪去結(jié)扎線，連同硅膠管一同取出，進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組只在相應(yīng)部位穿線不結(jié)扎。關(guān)閉胸腔，逐層縫合肌肉、皮膚，術(shù)后腹腔注射青霉素10 萬單位預(yù)防感染。結(jié)扎成功標(biāo)志: 結(jié)扎下方心肌顏色變灰白，同時心電圖ST 段進(jìn)行性抬高甚至弓背向上( 較正常至少抬高2 mm) 。復(fù)灌成功標(biāo)志: 心臟顏色由灰白逐漸恢復(fù)正常，或30 min 內(nèi)心電圖ST 下降至少50%。造模前心率<350 次/min 者，未到規(guī)定時間死亡者及造模不成功者予以剔除。

　　2. 3 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測

　　2. 3. 1 再灌注2 h 心肌酶、內(nèi)皮功能檢測每組取6 只大鼠，采集血清，以全自動生化分析儀檢測LDH及CK-MB，以放射免疫法檢測血清ET-1，紫外分光光度計檢測血清NO 水平，紫外分光光度計檢測心肌MDA，MPO 水平。

　　2. 3. 2 心肌梗死面積測定未取血大鼠于再灌注48 h 時處死，術(shù)前與取材前B 超檢測心臟射血分?jǐn)?shù)，從大鼠左肺靜脈注射0. 5%依文思藍(lán)約1. 5 mL，待大鼠口唇爪甲變藍(lán)后摘取心臟，以冰鹽水沖洗，擦干，置于- 20 ℃凍存20 min 后，沿結(jié)扎線以下切成等厚的4 ～ 5 片，放入1% TTC 溶液中，37 ℃ 孵育15 ～ 20 min，流水沖洗。非缺血區(qū)呈藍(lán)色，缺血未梗死區(qū)呈磚紅色，缺血區(qū)( area at risk，AAR) 為灰白區(qū)與磚紅色區(qū)域之和，梗死區(qū)( area of necrosis，AN) 呈灰白色，放置于10%甲醛中室溫固定24 h。然后用L2035AW Pioneer 數(shù)碼照相機(jī)進(jìn)行圖像采集，以Version 6. 0 Media Cybernetics Image-Pro Plus 圖像分析軟件分別計算出梗死區(qū)、占缺血區(qū)面積的比例，缺血區(qū)占左室面積的比例。

　　2. 3. 3 Western blot 法檢測心肌Caspase-3，Bax 及Bcl-2 蛋白表達(dá)每組取6 只大鼠分別檢測心肌Caspase-3，Bax 及Bcl-2 蛋白表達(dá)。根據(jù)試劑說明書提取蛋白，BCA 法檢測組織蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，上樣，根據(jù)蛋白目的分子量設(shè)定電泳條件，轉(zhuǎn)膜，封閉，經(jīng)一抗( 1 ∶ 1 000) ，二抗孵育，顯色曝光，將顯色后的圖片掃描后，使用Gel Image system ver. 4. 00軟件( 上海天能科技有限公司) 對圖像進(jìn)行灰度分析。以目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

　　2. 3. 4 TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡每組取6 只大鼠做心臟石蠟切片，脫水，蛋白酶K 中孵育后避光條件下加稀釋液，TUNEL 反應(yīng)液，37 ℃放置1 h 轉(zhuǎn)化converter-POD( POD) ，37 ℃ 烤箱中放置30 min，取出沖洗后加DAB，經(jīng)蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯溶液透明，封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察，其中正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)出深淺不一的棕褐色。每張切片于凋亡細(xì)胞分布相同區(qū)域隨機(jī)選取5 個高倍視野，計算平均每個視野中的凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，即為凋亡指數(shù)。

　　2. 4 統(tǒng)計學(xué)處理

　　采用SPSS 17. 0 統(tǒng)計軟件。計量資料結(jié)果以珋x ± s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，P < 0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。