引言

　　氣孔作為植物與外界環(huán)境進(jìn)行氣體交換（主要是CO2和H2O）的重要通道，在調(diào)節(jié)植物光合作用、蒸騰作用以及水分利用中扮演 著 至 關(guān) 重 要 的 角色[1].近年來通過研究氣孔發(fā)育異常的突變體，發(fā)現(xiàn)了許多調(diào)控氣孔發(fā)育的基因，因此對(duì)氣孔發(fā)育基本遺傳途徑的認(rèn)識(shí)越來越清晰。植物氣孔發(fā)育受到多種環(huán)境因素影響，如二氧化碳和水蒸氣，而研究表明一氧化氮（nitric oxide,NO）作為廣泛分布于生物體內(nèi)的活性小分子，參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育的許多過程[2].那么NO是否也能影響植物氣孔發(fā)育，目前還沒有相關(guān)報(bào)道，為了探究NO在氣孔發(fā)育過程中的功能，本實(shí)驗(yàn)利用外源NO處理，以及NO含量變化突變 體，證 明NO調(diào) 節(jié) 擬 南 芥 氣 孔 發(fā) 育 過 程，qRT-PCR結(jié)果表明，NO影響氣孔發(fā)育相關(guān)基因MUTE、SCRM及SCRM2的表達(dá)。本結(jié)果為植物氣孔發(fā)育的調(diào)控提供了新的證據(jù)，對(duì)于改良植物的抗旱性具有重要的理論價(jià)值。

　　1 材料與方法

　　1.1材料及處理方法

　　實(shí) 驗(yàn) 所 用 野 生 型 擬 南 芥 （Arabidopsisthaliana L.）為Columbia-0生態(tài)型，擬南芥突變體nox1（CS3156）和noa1（CS6511）均購于擬南芥信息資源庫（The Arabidopsis Information Resource）擬南 芥 種 子 經(jīng) 過 消 毒 液 （5% NaClO和0.01%Triton X-100）消毒5min后，無菌水清洗3次，4℃春化3d后播種于含1%蔗糖和0.8%瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基（pH 5.8）。

　　外源SNP處理時(shí)，先將種子在1/2MS培養(yǎng)基中萌發(fā)1d,然后移至提前添加不同濃度SNP的1/2MS培養(yǎng)基中，SNP濃度分別為0、10、20、30和40μmol·L-1.以上材料均置于擬南芥培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為22℃,光周期為16h光照/8h黑暗，光照強(qiáng)度為100μmol·m-2·s-1,濕度為80%~90%.

　　1.2實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1顯微技術(shù)取新鮮葉片投入脫色液（V乙醇 ∶V乙酸 =19∶1）中脫色1h,再將脫去葉綠素的葉片浸入透明劑中透明1h,然后用Olympus BX60微分干涉差顯微鏡（differential interference contrast microscope,DIC）照相。透明劑配方為：水合氯醛80g,甘油10mL,用水定容至100mL.

　　1.2.2氣孔相關(guān)參數(shù)統(tǒng)計(jì)野生 型WT,突 變 體nox1（CS3156）和noa1（CS6511）三個(gè)株系分別隨機(jī)選擇十株七天的幼苗，觀察統(tǒng)計(jì)幼苗子葉下表皮的氣孔指數(shù)（stomatal in-dex,SI）和%（GMC+M）。拍照時(shí)每個(gè)子葉拍攝兩個(gè)不重疊、避開葉脈和葉邊緣的圖片，借助ImageJ軟件來統(tǒng)計(jì)SI和%（GMC+M），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

　　擬南芥的氣孔發(fā)育要經(jīng)歷三種不同的前體細(xì)胞：擬分生組織母細(xì)胞（MMC）、擬分生組織細(xì)胞（M）和保衛(wèi)母細(xì)胞（GMC）[3],為了更全面準(zhǔn)確地分析氣孔發(fā)育過程，一般將SI和%（GMC+M）作為衡量氣孔發(fā)育 的 指 標(biāo)。

　　SI=氣 孔 數(shù)/（氣 孔 數(shù)+表 皮 細(xì) 胞數(shù)）；%（GMC+M）=（保衛(wèi)母細(xì)胞數(shù)+分生組織細(xì)胞數(shù)）/（保衛(wèi)母細(xì)胞數(shù)+分生組織細(xì)胞數(shù)+氣孔數(shù)+表皮細(xì)胞數(shù)）[4].實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行處理，采用Origin 8軟件作圖，本文中所有統(tǒng)計(jì)作圖中Error bars代 表 標(biāo) 準(zhǔn) 誤 差 均 值。星 號(hào) 代 表 通 過student t test計(jì)算出的差異的顯著性程度（*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001）。

　　1.2.3 RNA提取和qRT-PCRRNA提?。河肨rizol（Invitrogen）提取生長(zhǎng)七天幼苗的子葉RNA,每個(gè)株系選取100株幼苗，實(shí)驗(yàn) 重復(fù)3次，具體步驟如下：液氮研磨幼苗，加入1mL的Trizol,劇烈震蕩15s,室溫靜置5min后移至冰上，4℃，12 000rpm,15min離心后取上層紅色液體于新的EP管中，之后加入200μL氯仿震蕩15s,室溫靜置2min.4 ℃，12 000rpm,15min離心后取上清于新的EP管中，加入500μL異丙醇，室溫靜置30min后再次4℃，12 000rpm,15min離心，吸去管中液體，留管底白色沉淀，用70%乙醇吹打沉淀使其懸浮，4 ℃，7 500rpm,5min離心后吸去乙醇，將EP管置于超凈臺(tái)干燥，最后加入20μLDEPC H2O溶解沉淀。

　　RNA反轉(zhuǎn)錄：用TOYOBO的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取好的RNA反轉(zhuǎn)為cDNA.總反應(yīng)體系為20μL,反應(yīng)程序?yàn)椋篟NA 1~2μɡ,oligo（dT）5pmol,10mmol·L-1dNTP 1μL,DEPC H2O補(bǔ)足到14μL,65℃孵育5min,取出后放置于冰上，向反應(yīng)體系加入5×Reaction Buffer 4μL,RNase Inhibitor1μL,42℃保溫2min后，加入1μL反轉(zhuǎn)錄酶，于42℃反應(yīng)50min之后，72℃孵育15min將反轉(zhuǎn)錄酶滅活。反應(yīng)結(jié)束后樣品降溫至4℃，cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

　　熒光定量PCR:定量分析氣孔發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量，先 按 照 上 述 方 法 提 取RNA,反 轉(zhuǎn) 錄 成cDNA,本實(shí)驗(yàn)使用UBQ5作為內(nèi)參基因，實(shí)驗(yàn)所用引物序列見表1,擴(kuò)增中SYBR-green作為熒光染料，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 3min,95℃ 15s,58℃ 15s,72℃15s,讀取熒光值，重復(fù)上述步驟，45個(gè)循環(huán)；95℃10s;60℃到95℃做 溶 解 曲 線，每5s升 溫0.5℃并讀取一次熒光值。

　　所有實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行了3次以上的重復(fù)，每次生物重復(fù) 都 包 含3次 技 術(shù) 重 復(fù)。 使 用Comparativethreshold cycle（Ct）方法來計(jì)算擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)量。

　　2 結(jié)果與討論

　　2.1外源NO對(duì)擬南芥葉片氣孔發(fā)育的影響

　　環(huán)境因素能夠影響氣孔運(yùn)動(dòng)，也能影響氣孔發(fā)育。在擬南芥中，提高CO2水平能夠降低植物的氣孔密度（單位葉面積內(nèi)的氣孔數(shù)目）[5],最新研究表明，編碼β-碳酸酐酶的兩個(gè)基因CA1,CA2和CO2誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白酶CRSP共同參與了CO2對(duì)氣孔發(fā)育的影響[6].高光強(qiáng)也能提高氣孔指數(shù)[7].目前已知NO能夠激活MAPK信號(hào)通路[8],而MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)在氣孔發(fā)育中起至關(guān)重要的作用[9].

　　SNP處理WT后統(tǒng)計(jì)幼苗子葉下表皮的氣孔指數(shù)和%（GMC+M），如圖1,外源SNP處理使擬南芥幼苗子葉下表皮的氣孔數(shù)增多，擬分生組織細(xì)胞（M）和保衛(wèi)母細(xì)胞（GMC）數(shù)目增多；SNP處理提高了擬南芥氣SI和%（GMC+M），并且在10~30μmol·L-1SNP濃 度 范 圍 內(nèi)，隨 著 濃 度 升 高，SI和%（GMC+M）均顯著增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源NO能提高SI和%（GMC+M）

　　2.2擬南芥內(nèi)源

　　NO含量變化對(duì)氣孔發(fā)育的影響觀察WT,noa1,nox1萌發(fā)七天的幼苗子葉下表皮，統(tǒng)計(jì)SI和%（GMC+M），如圖2,NO降低突變體noa1子葉表皮的氣孔數(shù)少于WT,而NO升高突變體nox1子葉表皮的氣孔數(shù)目和擬分生組織細(xì)胞（M）和保衛(wèi)母細(xì)胞（GMC）數(shù)目均高于WT;NO含量降低突變體noa1的SI和%（GMC+M）均顯著低于WT,而NO含量升高突變體nox1的SI和%（GMC+M）均顯著高于WT.

　　2.3 NO影響氣孔發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)

　　近年來發(fā)現(xiàn)了許多調(diào)控氣孔發(fā)育的基因，研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中有五個(gè)編碼bHLH蛋白的基因調(diào)控氣孔 世 系 的 起 始 和 發(fā) 展，包 括SPEECHLESS（SPCH）、MUTE、FAMA、SCRM（ICE）、SCRM2[10,11].SCRM和SCRM2通 過 與 三 個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成異二聚體，分別特化氣孔發(fā)育中的三步級(jí)聯(lián)：

　　SPCH和SCRM/SCRM2啟動(dòng)氣孔世系的第一次不對(duì)稱分裂，而MUTE和SCRM/SCRM2促進(jìn)擬分生組織細(xì)胞向保衛(wèi)母細(xì)胞（GuardMother Cell,GMC）的轉(zhuǎn)變。

　　研究表明，mute突變體中，擬分生組織細(xì)胞（M）增多，而在scrm1-2中GMC-like細(xì)胞增多，scrm1-2scrm2-1/+中擬分生組織細(xì)胞（M）增多[11].而我們的結(jié)果表明，NO也會(huì)導(dǎo)致%（GMC+M）升高，為了探究NO是否通過這些基因調(diào)控%（GMC+M）,利用qRT-PCR技術(shù)，比較分析了WT、nox1、noa1中氣孔發(fā)育相關(guān)基因MUTE、SCRM和1的表達(dá)，如圖3,結(jié)果顯示，nox1中MUTE,SCRM和SCRM2三個(gè)基因的表達(dá)均低于WT,而noa1中這三個(gè)基因的表達(dá)均高于WT.同時(shí)，30μM SNP處理WT后，MUTE,SCRM和SCRM2表達(dá)水平均低于對(duì)照組，和nox1一致，表明NO影響了氣孔發(fā)育相關(guān)基因MUTE,SCRM和SCRM2的表達(dá)。

　　以 上 結(jié) 果 表 明，NO可 能 通 過 調(diào) 控MUTE,SCRM和SCRM2三個(gè)基因的表達(dá)影響了擬南芥氣孔發(fā)育過程中的細(xì)胞轉(zhuǎn)變，使更多的細(xì)胞停留在擬分生組織細(xì)胞（M）和保衛(wèi)母細(xì)胞（GMC）時(shí)期，因此導(dǎo)致了%（GMC+M）水平的提高。目前尚不清楚NO如何在阻礙部分細(xì)胞分化的同時(shí)提高SI,由于影響氣孔發(fā)育有多條信號(hào)通路[12],因此我們推測(cè)NO可能通過影響其他基因來影響氣孔指數(shù)。

　　3 結(jié)論

　　SNP處理WT后的SI和%（GMC+M）均高于對(duì)照 組，并 且NO升 高 突 變 體nox1的SI和%（GMC+M）顯著高于WT,而NO降低突變體noa1的SI和%（GMC+M）均低于WT.這些內(nèi)源NO含量變化突變體氣孔的異常發(fā)育表明，內(nèi)源NO對(duì)于擬 南 芥 氣 孔 發(fā) 育 具 有 重 要 的 作 用。

　　MUTE、SCRM和SCRM2調(diào)控氣孔發(fā)育，MUTE促進(jìn)擬分生組 織 細(xì) 胞 （M）向 保 衛(wèi) 母 細(xì) 胞 （GMC）的 轉(zhuǎn) 變，SCRM和SCRM2所編碼的蛋白以二聚體的形式輔助MUTE行使功能已見報(bào) 道，qRT-PCR結(jié) 果表明，nox1中MUTE、SCRM、SCRM2的表達(dá)水平均低于WT,外源SNP處理結(jié)果與nox1一致，而noa11MUTE、SCRM、SCRM2的 表 達(dá) 水 平 均 高 于WT.綜 上 所 述，NO可 提 高 擬 南 芥 的SI和%（GMC+ M）水 平，同 時(shí) 調(diào) 控 氣 孔 發(fā) 育 相 關(guān) 基 因MUTE、SCRM、SCRM2的表達(dá)。

　　NO作為一種重要的信號(hào)分子，通過調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平以及轉(zhuǎn)錄后蛋白修飾參與植物發(fā)育過程。同時(shí)，植物氣孔的發(fā)育受多條信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)。

　　本實(shí)驗(yàn) 的 結(jié) 果 表 明，NO可 能 通 過 調(diào) 控MUTE、SCRM、SCRM2等基因的表達(dá)影響擬南芥氣孔發(fā)育1%（GMC+M）的水平。關(guān)于NO如何調(diào)控這些基因的表達(dá)，以及如何影響SI還需要進(jìn)一步的研究和探索。