引言

　　氣孔作為植物與外界環境進行氣體交換（主要是CO2和H2O）的重要通道，在調節植物光合作用、蒸騰作用以及水分利用中扮演 著 至 關 重 要 的 角色[1].近年來通過研究氣孔發育異常的突變體，發現了許多調控氣孔發育的基因，因此對氣孔發育基本遺傳途徑的認識越來越清晰。植物氣孔發育受到多種環境因素影響，如二氧化碳和水蒸氣，而研究表明一氧化氮（nitric oxide,NO）作為廣泛分布于生物體內的活性小分子，參與了植物生長發育的許多過程[2].那么NO是否也能影響植物氣孔發育，目前還沒有相關報道，為了探究NO在氣孔發育過程中的功能，本實驗利用外源NO處理，以及NO含量變化突變 體，證 明NO調 節 擬 南 芥 氣 孔 發 育 過 程，qRT-PCR結果表明，NO影響氣孔發育相關基因MUTE、SCRM及SCRM2的表達。本結果為植物氣孔發育的調控提供了新的證據，對于改良植物的抗旱性具有重要的理論價值。

　　1 材料與方法

　　1.1材料及處理方法

　　實 驗 所 用 野 生 型 擬 南 芥 （Arabidopsisthaliana L.）為Columbia-0生態型，擬南芥突變體nox1（CS3156）和noa1（CS6511）均購于擬南芥信息資源庫（The Arabidopsis Information Resource）擬南 芥 種 子 經 過 消 毒 液 （5% NaClO和0.01%Triton X-100）消毒5min后，無菌水清洗3次，4℃春化3d后播種于含1%蔗糖和0.8%瓊脂的1/2MS培養基（pH 5.8）。

　　外源SNP處理時，先將種子在1/2MS培養基中萌發1d,然后移至提前添加不同濃度SNP的1/2MS培養基中，SNP濃度分別為0、10、20、30和40μmol·L-1.以上材料均置于擬南芥培養箱中，培養溫度為22℃,光周期為16h光照/8h黑暗，光照強度為100μmol·m-2·s-1,濕度為80%~90%.

　　1.2實驗方法

　　1.2.1顯微技術取新鮮葉片投入脫色液（V乙醇 ∶V乙酸 =19∶1）中脫色1h,再將脫去葉綠素的葉片浸入透明劑中透明1h,然后用Olympus BX60微分干涉差顯微鏡（differential interference contrast microscope,DIC）照相。透明劑配方為：水合氯醛80g,甘油10mL,用水定容至100mL.

　　1.2.2氣孔相關參數統計野生 型WT,突 變 體nox1（CS3156）和noa1（CS6511）三個株系分別隨機選擇十株七天的幼苗，觀察統計幼苗子葉下表皮的氣孔指數（stomatal in-dex,SI）和%（GMC+M）。拍照時每個子葉拍攝兩個不重疊、避開葉脈和葉邊緣的圖片，借助ImageJ軟件來統計SI和%（GMC+M），實驗重復3次。

　　擬南芥的氣孔發育要經歷三種不同的前體細胞：擬分生組織母細胞（MMC）、擬分生組織細胞（M）和保衛母細胞（GMC）[3],為了更全面準確地分析氣孔發育過程，一般將SI和%（GMC+M）作為衡量氣孔發育 的 指 標。

　　SI=氣 孔 數/（氣 孔 數+表 皮 細 胞數）；%（GMC+M）=（保衛母細胞數+分生組織細胞數）/（保衛母細胞數+分生組織細胞數+氣孔數+表皮細胞數）[4].實驗數據用Microsoft Excel 2003軟件進行處理，采用Origin 8軟件作圖，本文中所有統計作圖中Error bars代 表 標 準 誤 差 均 值。星 號 代 表 通 過student t test計算出的差異的顯著性程度（*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001）。

　　1.2.3 RNA提取和qRT-PCRRNA提?。河肨rizol（Invitrogen）提取生長七天幼苗的子葉RNA,每個株系選取100株幼苗，實驗 重復3次，具體步驟如下：液氮研磨幼苗，加入1mL的Trizol,劇烈震蕩15s,室溫靜置5min后移至冰上，4℃，12 000rpm,15min離心后取上層紅色液體于新的EP管中，之后加入200μL氯仿震蕩15s,室溫靜置2min.4 ℃，12 000rpm,15min離心后取上清于新的EP管中，加入500μL異丙醇，室溫靜置30min后再次4℃，12 000rpm,15min離心，吸去管中液體，留管底白色沉淀，用70%乙醇吹打沉淀使其懸浮，4 ℃，7 500rpm,5min離心后吸去乙醇，將EP管置于超凈臺干燥，最后加入20μLDEPC H2O溶解沉淀。

　　RNA反轉錄：用TOYOBO的反轉錄試劑盒將提取好的RNA反轉為cDNA.總反應體系為20μL,反應程序為：RNA 1~2μɡ,oligo（dT）5pmol,10mmol·L-1dNTP 1μL,DEPC H2O補足到14μL,65℃孵育5min,取出后放置于冰上，向反應體系加入5×Reaction Buffer 4μL,RNase Inhibitor1μL,42℃保溫2min后，加入1μL反轉錄酶，于42℃反應50min之后，72℃孵育15min將反轉錄酶滅活。反應結束后樣品降溫至4℃，cDNA保存于-20℃備用。

　　熒光定量PCR:定量分析氣孔發育相關基因的表達量，先 按 照 上 述 方 法 提 取RNA,反 轉 錄 成cDNA,本實驗使用UBQ5作為內參基因，實驗所用引物序列見表1,擴增中SYBR-green作為熒光染料，反應程序為：95℃ 3min,95℃ 15s,58℃ 15s,72℃15s,讀取熒光值，重復上述步驟，45個循環；95℃10s;60℃到95℃做 溶 解 曲 線，每5s升 溫0.5℃并讀取一次熒光值。

　　所有實驗都進行了3次以上的重復，每次生物重復 都 包 含3次 技 術 重 復。 使 用Comparativethreshold cycle（Ct）方法來計算擴增產物的相對量。

　　2 結果與討論

　　2.1外源NO對擬南芥葉片氣孔發育的影響

　　環境因素能夠影響氣孔運動，也能影響氣孔發育。在擬南芥中，提高CO2水平能夠降低植物的氣孔密度（單位葉面積內的氣孔數目）[5],最新研究表明，編碼β-碳酸酐酶的兩個基因CA1,CA2和CO2誘導產生的蛋白酶CRSP共同參與了CO2對氣孔發育的影響[6].高光強也能提高氣孔指數[7].目前已知NO能夠激活MAPK信號通路[8],而MAPK信號級聯在氣孔發育中起至關重要的作用[9].

　　SNP處理WT后統計幼苗子葉下表皮的氣孔指數和%（GMC+M），如圖1,外源SNP處理使擬南芥幼苗子葉下表皮的氣孔數增多，擬分生組織細胞（M）和保衛母細胞（GMC）數目增多；SNP處理提高了擬南芥氣SI和%（GMC+M），并且在10~30μmol·L-1SNP濃 度 范 圍 內，隨 著 濃 度 升 高，SI和%（GMC+M）均顯著增加。實驗結果表明，外源NO能提高SI和%（GMC+M）

　　2.2擬南芥內源

　　NO含量變化對氣孔發育的影響觀察WT,noa1,nox1萌發七天的幼苗子葉下表皮，統計SI和%（GMC+M），如圖2,NO降低突變體noa1子葉表皮的氣孔數少于WT,而NO升高突變體nox1子葉表皮的氣孔數目和擬分生組織細胞（M）和保衛母細胞（GMC）數目均高于WT;NO含量降低突變體noa1的SI和%（GMC+M）均顯著低于WT,而NO含量升高突變體nox1的SI和%（GMC+M）均顯著高于WT.

　　2.3 NO影響氣孔發育相關基因的表達

　　近年來發現了許多調控氣孔發育的基因，研究發現擬南芥中有五個編碼bHLH蛋白的基因調控氣孔 世 系 的 起 始 和 發 展，包 括SPEECHLESS（SPCH）、MUTE、FAMA、SCRM（ICE）、SCRM2[10,11].SCRM和SCRM2通 過 與 三 個bHLH轉錄因子形成異二聚體，分別特化氣孔發育中的三步級聯：

　　SPCH和SCRM/SCRM2啟動氣孔世系的第一次不對稱分裂，而MUTE和SCRM/SCRM2促進擬分生組織細胞向保衛母細胞（GuardMother Cell,GMC）的轉變。

　　研究表明，mute突變體中，擬分生組織細胞（M）增多，而在scrm1-2中GMC-like細胞增多，scrm1-2scrm2-1/+中擬分生組織細胞（M）增多[11].而我們的結果表明，NO也會導致%（GMC+M）升高，為了探究NO是否通過這些基因調控%（GMC+M）,利用qRT-PCR技術，比較分析了WT、nox1、noa1中氣孔發育相關基因MUTE、SCRM和1的表達，如圖3,結果顯示，nox1中MUTE,SCRM和SCRM2三個基因的表達均低于WT,而noa1中這三個基因的表達均高于WT.同時，30μM SNP處理WT后，MUTE,SCRM和SCRM2表達水平均低于對照組，和nox1一致，表明NO影響了氣孔發育相關基因MUTE,SCRM和SCRM2的表達。

　　以 上 結 果 表 明，NO可 能 通 過 調 控MUTE,SCRM和SCRM2三個基因的表達影響了擬南芥氣孔發育過程中的細胞轉變，使更多的細胞停留在擬分生組織細胞（M）和保衛母細胞（GMC）時期，因此導致了%（GMC+M）水平的提高。目前尚不清楚NO如何在阻礙部分細胞分化的同時提高SI,由于影響氣孔發育有多條信號通路[12],因此我們推測NO可能通過影響其他基因來影響氣孔指數。

　　3 結論

　　SNP處理WT后的SI和%（GMC+M）均高于對照 組，并 且NO升 高 突 變 體nox1的SI和%（GMC+M）顯著高于WT,而NO降低突變體noa1的SI和%（GMC+M）均低于WT.這些內源NO含量變化突變體氣孔的異常發育表明，內源NO對于擬 南 芥 氣 孔 發 育 具 有 重 要 的 作 用。

　　MUTE、SCRM和SCRM2調控氣孔發育，MUTE促進擬分生組 織 細 胞 （M）向 保 衛 母 細 胞 （GMC）的 轉 變，SCRM和SCRM2所編碼的蛋白以二聚體的形式輔助MUTE行使功能已見報 道，qRT-PCR結 果表明，nox1中MUTE、SCRM、SCRM2的表達水平均低于WT,外源SNP處理結果與nox1一致，而noa11MUTE、SCRM、SCRM2的 表 達 水 平 均 高 于WT.綜 上 所 述，NO可 提 高 擬 南 芥 的SI和%（GMC+ M）水 平，同 時 調 控 氣 孔 發 育 相 關 基 因MUTE、SCRM、SCRM2的表達。

　　NO作為一種重要的信號分子，通過調控基因的轉錄水平以及轉錄后蛋白修飾參與植物發育過程。同時，植物氣孔的發育受多條信號途徑的調節。

　　本實驗 的 結 果 表 明，NO可 能 通 過 調 控MUTE、SCRM、SCRM2等基因的表達影響擬南芥氣孔發育1%（GMC+M）的水平。關于NO如何調控這些基因的表達，以及如何影響SI還需要進一步的研究和探索。