PCR自我鑒定

篇一：PCR個人經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

　　PCR經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

　　1. primers design

　　這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件

　　a 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當(dāng)然不是說越長越好,太長的引物同樣會降低特異性,并且降低產(chǎn)量。

　　b GC% 40%-60%

　　c 5'端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性

　　d 避免3'端GC rich, 最后3個BASE不要有GC,或者最后5個有3個不要是GC e. 避免3'端的互補(bǔ), 否則容易造成DIMER

　　f. 避免3'端的錯配

　　g. 避免內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)

　　h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值時不需要加上這些序列,但在檢測互補(bǔ) 和二級結(jié)構(gòu)是要加上它們

　　i. 需要使用兼并引物時, 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用較高的引物濃度(1uM-3uM)

　　j. 最好學(xué)會使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.

　　* 引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的 Tm低5℃。

　　設(shè)定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計算機(jī)程序使用近鄰分析法。 根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋€估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點(diǎn)?？梢酝ㄟ^分析幾個逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。

　　為獲得最佳結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計的退火溫度先進(jìn)行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。

　　2. stability of primers

　　定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運(yùn)輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因?yàn)樗膒H經(jīng)常偏酸，會引起寡核苷的水解。引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在 -20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存 2個月。

　　3. optimize reactants concentration

　　a. magnesiom ions

　　Mg離子的作用主要是 dNTP-Mg 與核酸骨架相互作用，并能影響Polymerase的活性。

　　一般 的情況下 Mg的濃度在0.5-5mM之間調(diào)整。同樣要記住的是在調(diào)整了dNTPs的濃度后要相應(yīng)的調(diào)整Mg離子的濃度。對實(shí)時定量PCR，使用3-5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液。

　　b. 其他的離子

　　NH4+ K+都會影響PCR。增加K+的濃度后, 會因?yàn)橹泻土撕怂峁羌苌狭姿峄鶊F(tuán)的負(fù)電荷而影響退火的溫度,從而降低了PCR的 嚴(yán)謹(jǐn)性(stringency).NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了兩種BUFFER, 一種是加Mg的一種是已經(jīng)混合了(NH4)2SO4的.當(dāng)然, 過高的陽離子濃度(KCL>0.2M)時, DNA在94度根本不會發(fā)生變性, 當(dāng)然也就無從談起PCR了.

　　c. polymerase

　　不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度。一些高保真酶的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情況下, 變性的溫度可以使用90~92度, 變性的時間也可以縮短,從而保證polymerase的活性 d. template

　　50ul PCR SYSTEM

　　human gDNA 0.1ug-1ug

　　E.Coli 10ng-100ng

　　Lamada DNA 0.5ng-5ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng

　　4. temperature

　　a. denaturation

　　常規(guī)是94度5分鐘, GC Rich的摸板是95度5分鐘，除了GC Rich外, 常規(guī)的APPLICATIONS可以將這部分時間縮短到1到2分鐘, 或者在CYCLE 1時給予較長的時間,而取消開始的denaturation

　　b. annealing

　　重點(diǎn)到了。一般情況下, 是從55度開始.根據(jù)情況配合以Mg離子濃度進(jìn)行調(diào)整. 有條件的可以做gradient pcr. 退火的時間在30-60S, 時間短一些可以得到更好的效果. 因?yàn)? polymerase 在annealing temp.時也會有一些活性. 所以在A.T.的時間過長, 會極大的增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險.另外,在對于一些困難戶, 比如從gDNA里擴(kuò)增大片段, 還可使用two step PCR.

　　5. touchdown PCR

　　原理很簡單,但的確是一個很有用的方法。舉個例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度 94 5min—（94 30s—60 30s—72 1min）×2—（94 30s—59 30s—72 1min ）×2—（94 30s—58 30s—72 1min）×2—........—（94 30s—51 30s—72 1min）×2—（94 30s—50 30s—72 1min）×20—72 5min

　　6. hot start PCR

　　熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并

　　將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。

　　熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶，在反應(yīng)體系達(dá)到90度時，PAUSE，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這個方法 過于煩瑣，尤其是對高通量應(yīng)用，并容易造成污染。其他的熱啟動方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，加入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。

　　ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)

　　Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)

　　Magnesium wax beads (Stratagene).

　　象手動熱啟動方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。還有一種方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗體抑制失活，當(dāng)變性溫度超過70度時，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。

　　7. Booster PCR

　　我們知道1ug human genomic DNA 大約在3X105個模板分子,這樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結(jié)合. 當(dāng)模板的.濃度過低,比如低于100個分子時, 引物和模板之間就很難發(fā)生反應(yīng). 引物容易自身進(jìn)行反應(yīng)形成二聚體.這樣就有來了個 booster PCR 我一直找不到合適的詞來翻譯這個booster.具體是這樣的.開始幾個cycles保持primer的低濃度,保證primer:template的 molar ratio在107~ 108. 以確保開始擴(kuò)增的準(zhǔn)確性.然后booste Primer的濃度到正常的水平

　　8. 循環(huán)數(shù)和長度

　　確定循環(huán)數(shù)的基本原理是: 產(chǎn)物能夠保證你進(jìn)一步分析操作的最小循環(huán)數(shù).因?yàn)檫^多的循環(huán)數(shù)容易造 成ERRORS和非特異性產(chǎn)物的積累、產(chǎn)物的量不夠, 優(yōu)化的方法有:

　　1. 增加TEMPLATE

　　2. 增加循環(huán)數(shù)

　　如何確定循環(huán)數(shù),有一個方法.做一個PCR體系,40循環(huán),50ul, 分別在20,25,30,35循環(huán)時從體系中取5ul,一起跑電泳分析.從而確定最佳的循環(huán)數(shù)另一個會影響PCR特異性的是PCR cycling時在兩個溫度間變化的速率(ramping rate).當(dāng)然是越高越好.不過咱們大部分條件有限,就那么幾臺PCR儀,也沒有多少挑選的余地

　　9. thermal cycler

　　PCR儀的因素我們經(jīng)常容易忽視.長時間的使用后需要調(diào)整PCR儀,以保證其能夠到達(dá)正確的溫度.現(xiàn)在的PCR儀基本上都有自檢功能(self-diagnosis).

　　10. PCR additives

　　附加物或者說enhancer實(shí)在是多種多樣. 基本上包括幾類, 能夠增加反應(yīng)退火效率的化學(xué)因子, DNA結(jié)合蛋白和一些商業(yè)試劑. 基本的原理不外是增加引物退火特異性,減少錯配, 增加產(chǎn)物的長度和產(chǎn)量.在GC Rich情況中, additive可以造成配對堿基間的的不穩(wěn)定,從而提高擴(kuò)增的效率.而在另一種情況下,additive由于造成錯配的primer-template 復(fù)合物的極大的不穩(wěn)定, 而提高了擴(kuò)增的忠實(shí)性.要注意的是,沒有萬能的enhancer全部通用,需要你根據(jù)自己的情況,最好結(jié)合gradient pcr選擇最優(yōu)條件.

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　　dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%

　　formamide at 5%

　　trimethylammonium chloride 10-100uM

　　detergents such as Tween 20 0.1-2.5%

　　polyethylene glycol (PEG)6000 5-15%

　　glycerol 10-15%

　　single stranded DNA binding proteins

　　Gene 32 protein 1nM

　　E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM

　　7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP

　　Taq Extehder (stratagene)

　　Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)

　　Q-solution(Qiagen)

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　　要注意的是,DMSO,GLYCEROL等會抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最適的濃度

　　11. Template DNA preparation

　　提取DNA時的試劑會抑制PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行.因此需要對TEMPLATE DNA進(jìn)行純化.特別是SDS(<0.01%) 的情況下就能強(qiáng)烈抑制PCR的進(jìn)行. 可以加入一些nonionic試劑,如Tween, Nonid, Trition之類的反過來抑制SDS. 還有proteinase K也要除干凈, 不然會降解polymerase.

　　12. Nested PCR

　　簡單點(diǎn)說 設(shè)計兩對引物, 一對是長的, 一對是包含在長引物內(nèi)的, 用長引物擴(kuò)增的產(chǎn)物作為第二次擴(kuò)增的模板,這樣可以增加產(chǎn)物的量. 而且可以減少非特異性帶和錯配的情況. 增加PCR的保真性

　　高保真酶

　　高溫DNA POLYMERASE是以單鏈DNA或RNA為模板，在dNTP和一些陽離子的存在情況下，在特定的引物指導(dǎo)下按3'-5'方向合成DNA.包括3種類型：

　　a.5'-3'方向的DNA合成能力,沒有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突變體.這類酶的合成能力強(qiáng),因?yàn)樗患m正合成中出現(xiàn)的突變

　　b.與a類似,有合成活性,沒有3-5的外切活性.但他們能以RNA為模板,合成DNA. 如Tth DNA Polymerase

　　c.有DNA聚合活性,沒有逆轉(zhuǎn)錄活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠實(shí)性。但是這些聚合酶的產(chǎn)量比Taq DNA聚合酶低。 酶的混合物

　　將Taq DNA聚合酶同帶有3'到5'外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨(dú)Taq DNA聚合酶高的忠實(shí)性，并可以得到高產(chǎn)量及擴(kuò)增長模板。

　　其他因素

　　除了酶，高濃度的dNTP或鎂離子會降低忠實(shí)性。將dNTP的濃度從200μM降低到25-50μM可以增加精確度如果四種核苷的濃度不同，忠實(shí)性會受影響。進(jìn)行較少的PCR循環(huán)也會有助于增加忠實(shí)性，因?yàn)樵黾友h(huán)數(shù)目和產(chǎn)物長度就會增加突變可能性。