6種草本藥用植物種子超低溫保存技術(shù)研究論文

　　超低溫冷凍保存指將材料放置在低于-80 ℃的環(huán)境中保存，通常是用液氮（-196 ℃）作為貯藏源，大多數(shù)的植物種質(zhì)在液氮中新陳代謝活動(dòng)基本停止，處于“生機(jī)停頓”狀態(tài)[1]，可以達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的。因此已被廣泛應(yīng)用于生物種質(zhì)的長(zhǎng)期保存，應(yīng)用范圍也在不斷擴(kuò)大[2]。目前超低溫冷凍保存已成功應(yīng)用于植物材料、動(dòng)物干細(xì)胞、魚(yú)蝦精細(xì)胞、微生物等的保存。其中植物材料包括種子、懸浮細(xì)胞[3]、愈傷組織[4]、胚[5-6]、花粉[7]、莖尖分生組織[8]、芽等。國(guó)內(nèi)外針對(duì)藥用植物種子超低溫保存的研究不多，李海兵等[9]對(duì)懷山藥種質(zhì)、何明高等[10]對(duì)束花石斛種子、任淑娟等[11]對(duì)七葉樹(shù)種子、Hirano等[12]對(duì)白芨種子進(jìn)行了超低溫保存，在藥用植物種質(zhì)超低溫保存方式、種子含水量、化凍方式對(duì)超低溫保存后種質(zhì)存活率的影響取得了成果。

　　草本植物是區(qū)別于木本植物的一類植物的總稱，包括重要的糧食如小麥、玉米等，且有很多草本植物是中藥材的重要來(lái)源，例如黃芪、夏枯草、人參等。本研究對(duì)具有藥用價(jià)值的杜若、過(guò)江藤、夏枯草、皺果莧、羅勒和山香等6種草本藥用植物種子進(jìn)行超低溫保存研究，對(duì)這些藥用植物種子超低溫保存的可行性和技術(shù)方法進(jìn)行了探討，為具有藥用價(jià)值的草本植物的保護(hù)性開(kāi)發(fā)提供技術(shù)。

1 材料與方法

　　1.1 材料

　　供試材料來(lái)自海南和廣東的草本植物杜若、過(guò)江藤、夏枯草、皺果莧、羅勒和山香種子，由國(guó)家南藥基因資源庫(kù)提供（表1）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 種子含水量測(cè)定 根據(jù)《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》（ISTA編，1999）采用高溫烘干法測(cè)定種子含水量（ω0），烘干溫度（103±2）℃，烘干時(shí)間16 h。ω0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。

　　1.2.2 種子干燥 采用硅膠干燥法。將種子放入盛有硅膠的干燥器中，根據(jù)自然含水量經(jīng)不同時(shí)間干燥分別獲得含水量為13.50%（自然含水量）、11.90%、9.68%、7.89%和5.71%的杜若種子，含水量為11.20%（自然含水量）、10.69%、9.69%、8.44%和8.10%的過(guò)江藤種子，含水量為10.63%（自然含水量）、9.88%、8.02%和6.99%的夏枯草種子，含水量為16.18%（自然含水量）、13.88%、12.75%、10.67%和8.56%的皺果莧種子，含水量為26.33%（自然含水量）、20.87%、18.18%、13.86%和7.78%的羅勒種子和含水量為12.82%（自然含水量）、9.09%、7.63%、5.45%和4.55%的山香種子。

　　1.2.3 種子發(fā)芽方法 參照《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》的規(guī)定。各試驗(yàn)4個(gè)重復(fù)，每重復(fù)40粒。計(jì)算出種子（種胚）的發(fā)芽率=種子發(fā)芽數(shù)/實(shí)驗(yàn)種子數(shù)×100%。

　　1.2.4 超低溫保存方法 目前使用的液氮超低溫保存方法主要有：緩慢冷凍法、直接冷凍法、玻璃化冷凍法、包埋脫水冷凍法、包埋玻璃化冷凍法等。根據(jù)實(shí)際情況，本實(shí)驗(yàn)選用緩慢冷凍法、直接冷凍法和玻璃化冷凍法對(duì)6種草本藥用植物種子進(jìn)行液氮超低溫保存實(shí)驗(yàn)。

　　緩慢冷凍法：將種子放入加有保護(hù)液（PVS2）（室溫）的凍存管中，置于4 ℃冰箱中0.5 h，取出立即放入-20 ℃冰柜中1 h，1 h后迅速投入液氮中保存。PVS2：30%甘油+15%乙二醇+15%二甲亞砜+0.4 mol/L蔗糖。

　　直接冷凍法：將種子放入凍存管中直接投入液氮中保存。

　　玻璃化冷凍法：將種子放于裝載液（LS）中室溫處理20 min后，轉(zhuǎn)入PVS2進(jìn)行30 min的冰水浴處理。冰水浴處理后將種子轉(zhuǎn)移至裝有預(yù)冷新鮮PVS2的.凍存管中，迅速投入液氮中保存。LS：含2 mol/L甘油和0.4 mol/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基。

　　解凍：取出液氮中凍存48 h的凍存管，室溫化凍5 min。

　　洗滌：將解凍后的種子在室溫下用洗滌液（US）洗滌2～3次，每次5～10 min，再用無(wú)菌水洗滌2～3次，每次5～10 min。US：含有1.2 mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)液。

　　恢復(fù)培養(yǎng)：洗滌后的種子在濾紙上吸干后，轉(zhuǎn)移至發(fā)芽盒， 25～30 ℃、70%RH條件下培養(yǎng)。

　　1.3 數(shù)據(jù)分析

　　數(shù)據(jù)采用SAS軟件和Excel（2016）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

　　2.1 超低溫保存對(duì)種子發(fā)芽率的影響

　　超低溫保存種子效果的判定一般采用測(cè)定發(fā)芽率的方法，以種子進(jìn)入液氮一段時(shí)間取出后有一定的發(fā)芽率來(lái)判定保存方法的成功與否[22]。本實(shí)驗(yàn)6種草本藥用植物種子經(jīng)液氮處理后都有一定的發(fā)芽率，具體結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，液氮超低溫冷凍對(duì)草本藥用植物種子發(fā)芽率影響不同，與對(duì)照組相比，其種子平均發(fā)芽率有降低的，也有提高的。經(jīng)3種不同冷凍方式處理冷凍后，杜若、夏枯草和皺果莧種子發(fā)芽率與對(duì)照相比，差異不顯著（p>0.05）；羅勒和山香種子其種子平均發(fā)芽率降低了15%～70%不等，其中降低幅度最大的是羅勒種子；過(guò)江藤種子平均發(fā)芽率由原來(lái)的61%提高至65.52%。

　　2.2 含水量對(duì)種子發(fā)芽率的影響

　　根據(jù)種子貯藏特性可將種子分為兩類，一類為耐脫水和低溫的正常性種子，另一類為不耐脫水和低溫的頑拗性種子[23]。由圖1可知，過(guò)江藤種子發(fā)芽率隨著含水量的下降而有所降低，從72.58%降至54.49%；而含水量的下降對(duì)杜若、夏枯草、皺果莧、山香和羅勒種子發(fā)芽率的影響不大，種子含水量低于10%時(shí)其發(fā)芽率均在70%以上。這表明過(guò)江藤種子不耐脫水干燥，杜若、夏枯草、皺果莧、山香和羅勒種子可脫水干燥。

　　超低溫冷凍過(guò)程中，種子的含水量是影響其生命力的一個(gè)關(guān)鍵因素。理論上講，含水量過(guò)高會(huì)使種子在冷凍和解凍過(guò)程中受到傷害甚至死亡，過(guò)低又會(huì)造成脫水傷害影響其活力[24]。本研究結(jié)果（圖1和表2），含水量5.71%～13.50%的杜若種子和8.56%～16.18%的皺果莧種子經(jīng)液氮超低溫冷凍后，其種子發(fā)芽率與對(duì)照相比，差異不顯著（p>0.05），且平均發(fā)芽率均在80%以上。液氮冷凍后的過(guò)江藤種子，除含水量9.69%外，其他含水量下的種子發(fā)芽率隨含水量的下降而急劇降低，與對(duì)照組相比，差異極顯著（p<0.01）。夏枯草種子含水量在6.99%～8.02%時(shí)，液氮冷凍后的種子發(fā)芽率較對(duì)照組下降明顯，含水量為9.88%～10.63%時(shí)，與對(duì)照組相比，液氮冷凍后的種子發(fā)芽率有所增加，這表明夏枯草種子超低溫冷凍的最佳含水量為8.02%。含水量5.45%～12.82%的山香種子，液氮超低溫處理前后其發(fā)芽率均存在顯著差異（p<0.05），且含水量低于7.63%的山香種子對(duì)照組發(fā)芽率隨含水量的下降而降低，冷凍組發(fā)芽率高于其它含水量，由此表明7.63%為山香種子液氮超低溫冷凍的最佳含水量。 羅勒種子含水量在7.78%～26.33%范圍時(shí)，液氮冷凍后其種子發(fā)芽率較對(duì)照組均存在極顯著差異（p<0.01）；含水量26.33%的羅勒種子冷凍后其發(fā)芽率幾乎為0，隨著含水量的下降，其冷凍組發(fā)芽率顯著提高。

　　2.3 冷凍方式對(duì)超低溫保存的影響

　　超低溫冷凍方式是液氮冷凍過(guò)程中影響種子活力的重要因素。常用的超低溫冷凍法有玻璃化冷凍、直接冷凍、緩慢冷凍、包埋冷凍等[25]，直接冷凍法能節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，且沒(méi)有化學(xué)物質(zhì)的傷害，但不是所有的種質(zhì)都適用于這個(gè)方式[26]。玻璃化溶液處理是緩慢冷凍法和玻璃化冷凍法的關(guān)鍵，玻璃化溶液中含有冷凍保護(hù)劑，易形成玻璃化狀態(tài)，并且很容易進(jìn)入植物組織中，一旦快速冷凍時(shí)，植物組織形成玻璃化狀態(tài)，進(jìn)一步使組織脫水，可以減輕傷害，提高存活率[27]。本研究采用了玻璃化冷凍、緩慢冷凍和直接冷凍3種冷凍方式對(duì)6種不同含水量范圍的草本藥用植物種子進(jìn)行液氮超低溫冷凍，由表2顯示結(jié)果如下。

　　含水量5.71%～13.50%的杜若種子，經(jīng)液氮超低溫冷凍后其種子發(fā)芽率較對(duì)照相比雖有差異，但變化幅度不大，平均發(fā)芽率都在80%以上，其中緩慢冷凍組和直接冷凍組的發(fā)芽率顯著高于玻璃化冷凍組。

　　含水量8.10%～11.20%的過(guò)江藤種子，液氮冷凍后，其緩慢冷凍組和直接冷凍組的種子發(fā)芽率隨含水量的降低而急劇下降，特別是含水量為8.44%時(shí)的直接冷凍組和含水量8.10%時(shí)的緩慢冷凍組，其發(fā)芽率均由55%降至27%左右，降低幅度最大；含水量由11.20%降至10.69%時(shí)，玻璃化冷凍組的種子發(fā)芽率由對(duì)照的66.67%降至57.14%，而含水量在8.10%～9.69%之間時(shí)，玻璃化冷凍組的種子發(fā)芽率均高于對(duì)照組。結(jié)果表明，過(guò)江藤種子液氮超低溫冷凍試驗(yàn)中，玻璃化冷凍法優(yōu)于緩慢冷凍法和直接冷凍法。

　　夏枯草種子含水量在6.99%～8.02%時(shí)，液氮冷凍后的種子發(fā)芽率較對(duì)照組有所下降，含水量6.99%的玻璃化冷凍組由75.76%降至45.83%，降低幅度最大；含水量在9.88%～10.63%時(shí)，液氮冷凍后的種子發(fā)芽率較對(duì)照組增加了，其中含水量10.63%的緩慢冷凍組增加幅度最大。結(jié)果顯示，緩慢冷凍后的種子平均發(fā)芽率顯著高于玻璃化冷凍和直接冷凍。

　　含水量為8.56%～16.18%的皺果莧種子，液氮超低溫冷凍后其種子發(fā)芽率雖有增加或降低，但變化幅度不大，平均發(fā)芽率都在82%以上，其中緩慢冷凍組的種子平均發(fā)芽率顯著高于玻璃化冷凍組和直接冷凍組。

　　山香種子含水量在4.55%～12.82%時(shí)，冷凍組的種子發(fā)芽率較對(duì)照組相比均下降了15%左右，其中含水量為9.09%時(shí)，冷凍后的種子發(fā)芽率低至60%，下降幅度最大；且玻璃化冷凍的種子平均發(fā)芽率顯著高于緩慢冷凍組和直接冷凍組。

　　羅勒種子含水量在7.78%～26.33%范圍時(shí)，液氮冷凍后其種子發(fā)芽率均有不同程度的下降，其中玻璃化冷凍組和緩慢冷凍組的種子發(fā)芽率甚至降為0；結(jié)果表明，直接冷凍法更適合于羅勒種子超低溫保存。