下面是小編搜集整理的植物基因工程課件，希望對大家有幫助！

　　植物基因工程課件

　?。?）植物基因轉化受體系統的條件

　?。?）植物基因轉化受體系統的類型和特性。

　　（3）植物基因工程載體的種類和特性

　　（4）根癌農桿菌Ti質粒的結構與功能：T-DNA、Vir區操縱子的基因結構與功能。

　?。?）農桿菌Ti質粒基因轉化機理

　?。?）農桿菌Ti質粒的改造及載體構建

　?。?）載體構建中常用的選擇標記及報告基因

　?。?）根癌農桿菌的轉化程序及操作原理

　?。?）外源基因在植物中的表達

　　了解植物基因轉化受體系統的類型、特性掌握Ti質粒的結構與功能，植物載體構建原理，植物基因工程常用的載體類型。

重點

　　根癌農桿菌Ti質粒介導的基因轉化的原理和方法

難點

　　植物載體構建原理

關鍵點

　　轉基因植物的獲取和檢測

教學目的和要求

　　教材分析

　　主要教具和設備材料

　　投影儀、電腦、常規教學設備板書與多媒體授課相結合

　　教法 思考題

　　1. 植物基因工程載體種類？

　　2. 根癌農桿菌轉化程序？

心得

　　在自然界的許多雙子葉植物中，常常發生一種嚴重危害植物生長的病害——冠癭。已知90多科，600多種雙子葉植物都能感染這種病。一般認為單子葉植物和裸子植物對此病不敏感。70年代中期，世界上幾個實驗室發現誘發腫瘤的根癌農桿菌中含有大量的誘瘤質粒Ti(tumor-inducing plasmid),且證實了腫瘤的形成正是由于pTi中的特定片段——T-DNA轉移并穩定地整合進植物細胞核基因組中的結果；由于其上載著的冠癭堿合成基因和激素合成基因表達，因此分泌冠癭堿并形成腫瘤。人們就把這種冠癭的形成過程稱作天然的植物細胞轉化系統。

　　農桿菌將自身的DNA插入植物細胞誘發腫瘤只對其本身是有益的，重要原因之一是因為農桿菌誘發植物細胞合成冠癭堿為自己提供食物。植物自身不能利用這種物質，只能為它的合成付出代價，別的細菌也不能利用它，在自然條件下，只有農桿菌能分泌分解冠癭堿的酶，將這些特異產物作為唯一的碳源和氮源來利用。

　　腫瘤的產生是由于T-DNA上的激素合成基因所致，刺激細胞生長而產生腫瘤，這是T-DNA轉入的一個副產品。

　　Ti質粒給自己設計出一套為其自身存活的非常優秀的進化格局：它感染植物細胞，使之出現愈傷組織增生，后者便產生出供帶有Ti質粒的細菌用作能源、碳源和氮源的冠癭堿；而冠癭堿的產生又可激發Ti質粒轉移到原先沒有存在這種質粒的土壤農桿菌中去，如此周而復始得到不斷發展。

　　Ti質粒是一類理想的植物基因工程載體，通過它們可以將外源DNA轉移到植物細胞，并再生出能夠表達外源基因的轉基因植物。 Ti質粒還具有若干其他載體所不具備的優點：

　?。?）T-DNA能夠進行高頻的轉移，而且這種轉移的DNA通常是以未發生變化的完整形式整合到植物的核基因組上。

　?。?）Ti質粒不存在包裝限制問題，大到50kb的外源DNA也能順利地包裝與轉移。

一、植物基因工程載體種類

　　據載體的功能和構建過程，可把有關載體分為四大類型（九種載體）。 克隆載體、中間載體、卸甲載體、轉化載體

　　據載體的功能和構建過程，可把有關載體分為四大類型，九種載體。

　　1、克隆載體（目的基因的克隆載體）

　　通常由多拷貝的E.coli小質粒為載體 功能：保存和克隆目的基因。

　　2、中間載體又分為中間克隆載體和中間表達載體。

　　中間克隆載體：由大腸桿菌質粒插入T-DN段及目的基因、標記基因等構建而成。

　　功能：構建中間表達載體的基礎。

　　分為：中間粘粒載體、質粒粘粒愈合載體、基因標記載體。 中間表達載體：含有植物特異啟動子的中間載體

　　功能：作為構建轉化載體的質粒。

　　3、卸甲載體

　　解除武裝的Ti質?；騌i質粒。（onc+ -------- onc-） 功能：作為轉化載體的受體質粒

　　4、轉化載體

　　最后用于目的基因導入植物細胞的載體，亦稱工程載體。 它是由中間表達載體和卸甲載體構建而成。

　　分為一元載體系統（順式載體）和雙元轉化載體系統（反式載體）。 一元載體系統包括共整合載體和拼接末端載體（SEV）。

二、根癌農桿菌Ti質粒

　　1、Ti質粒的類型、結構與功能

　　（1）類型

　　Ti質粒是根癌農桿菌染色體以外的遺傳物質，為雙股共價閉合的環狀DNA分子，分子量為95~156 x 106D，約150 ~ 200 Kb長。根據其誘導的冠癭堿種類不同，Ti質?？煞譃槿悾?章魚堿型（octopine）：pTiAch5, pTiA6NC, pTiB653, pTiAg162 胭脂堿型（nopaline）：pTiT37, pTiT38, pTiC58

　　農桿堿型（agropine）和農桿堿素型（agrocinopine）或琥珀堿型（succinamopine）

　　（2）結構和功能

　　各種Ti質粒都可分為四個區：

　?、賂-DNA區（transferred-DNA regions）：是農桿菌侵染植物細胞時，從Ti質粒上切割下來轉移到植物細胞的一段DNA。該DN段上的基因與腫瘤的形成有關。

　　②Vir區（Virulence region）：該區段上的基因能激活T-DNA轉移，使農桿菌表現出毒性，故稱之為毒性區。T-DNA區與vir區在質粒上彼此相鄰，合起來約占Ti質粒DNA的1/3。

　?、跜on區（region of replication）：質粒結合轉移位點編碼區，該區段上存在著與細菌間接合轉移的有關基因（tra），調控Ti質粒在農桿菌之間的轉移。冠癭堿能激活tra基因，誘導Ti質粒轉移，因此，稱之為接合轉移編碼區。

　　④Ori區（origin of replication）：該區段基因調控Ti質粒的自我復制，稱之為復制起始區。

　　3種成分與Ti質粒腫瘤誘導有關:

　　T-DNA：它可轉移至宿主細胞，是一種可移動因子。

　　毒性區：vir基因可產生轉移活動蛋白，對增強植物細胞的轉化是必須的。 土壤農癌桿菌染色體基因:間接參與轉化，負責將細菌細胞接合于植物上。

　　2、T-DNA的基因結構和功能

　?。?）T-DNA的結構特點 長約23Kb

　　在T-DNA的5’和3’端都有真核表達信號，如TATAbox，AATAAbox及polyA等。

　　T-DNA的兩端左右邊界各為25bp的重復序列，即邊界序列，分別稱之為左邊界（BL或TL）和右邊界（BR或TR）。該25bp邊界序列屬保守序列（TGACACGATATAT TGGCGGGTAAAC）。通常右邊界序列更為保守，左邊界在某些情況下有所變化。左邊界的缺失突變仍能致瘤，但右邊界缺失則不致瘤，這時幾乎完全沒有T-DNA的轉移，這說明右邊界在T-DNA的轉移中的重要性。

　　胭脂堿型腫瘤，為一連續的一段序列，長約23.4Kb，有腫瘤系，僅一個拷貝，有的T-DNA是多拷貝的。

　　章魚堿型腫瘤：T-DNA分左右兩部分（TL-DNA和TR-DNA），各自帶有左右邊界序列。左區的順序變化不大，長度約13Kb，通常一個拷貝，但也有幾個拷貝首尾相連排列。含章魚堿合成酶基因和致瘤基因。TR-DNA較短，長約6-7Kb，拷貝數達數個 或數十個，有的腫瘤系中沒有TR-DNA。TR-DNA編碼5個基因，如甘露堿和冠癭堿合成酶基因。

　?。?）T-DNA上的編碼基因及功能

　　章魚堿型和胭脂堿型T-DNA的轉錄有下述共同特點： T-DNA的兩條鏈都是有意義鏈；

　　T-DNA上每個基因都有各自的啟動子； 基因的轉錄由植物細胞RNA聚合酶II完成；

　　T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和終止的調節信號，在其5’端轉錄起始處有TATA和CAAT盒。另外，至少在5個T-DNA基因中發現有一個8bp的相同順序（TTTCAA GA），同時AATAAA加尾信號也在同一條鏈上發現。

　　植物或農桿菌中可能有甲基化或去甲基化的調節基因活性。 3、Vir區操縱子的基因結構與功能

　　毒性區的大多數基因產物都控制T-DNA的轉移，這個區域的突變往往導致農桿菌感染植物能力的下降。

　?。?）Vir區操縱子的基因結構

　　章魚堿型Ti質粒：Vir區大小為40kb，含有VirA、B、C、D、E、F、G、H（PinF）等8個操縱子，共24個基因。大多數操縱子含有多個基因VirA（1）、VirB（11）、VirC（2）、VirD（4）VirE（2）、VirF（1）、VirH（2）。

　　胭脂堿型Ti：有7個操縱子，少一個VirF，它們的第一個操縱子也不同，章魚堿型Ti是VirH，而胭脂堿型Ti是Tzs，其功能也不同。 Vir區基因的表達有兩種方式：

　　組成型表達；在無植物誘導分子存在下依然保持一定的表達水平，virA，virG、virH 誘導型表達：這些基因的表達必須在土壤農桿菌感染植物時，在植物受傷組織分泌的信號分子作用下才能啟動表達，如virB、C、D、E

　　virG雖屬于組成型表達，但有植物信號分子存在下表達量提高10倍，也具誘導表達特性。

　?。?）Vir區操縱子的基因的功能

　　①Vir A 單個基因，2.4kb，僅編碼一條多肽。Vir A編碼一種結合在膜上的化學受體蛋白（92KD），可直接對植物產生的酚類化合物感應，是一種感應蛋白。

　　Vir A的活化：當AS與Vir A的受體部分結合后，會使整個Vir A蛋白構象發生變化，其C端活化。Vir A蛋白的胞質區有自激酶的功能，可在保守的組氨酸殘基上磷酸化，從而Vir A蛋白被激活。激活后的Vir A具有轉移其磷酸基至Vir G蛋白的一個宿存的天冬氨酸殘基的能力，使Vir G蛋白激活。

　?、赩ir G Vir G ，只有1Kb，單基因，編碼DNA結合蛋白,其C端有DNA結合活性，N端具有磷酸化的酸性結構。

　　從總體效應講，Vir G基因是屬于組成型表達的，這對于細菌迅速地將外部環境信號傳遞到細胞內十分有利。

　　當磷酸化的A蛋白將其磷酸基轉到Vir G保守的天冬氨酸殘基上時，使Vir G蛋白活化，活化Vir G蛋白可以二體或多體形式結合到Vir啟動子的特定區，從而成為其它Vir 基因轉錄的激活因 子，打開Vir B、C、D、E、H等幾個基因。Vir A或G突變后會減弱或完全失去對其他Vir 位點活化的誘導，VirA及 Vir G 的這種調控作用被稱為雙因子調控體系。 ?Vir H、Vir F及Tzs

　　這些基因對質粒是特異的，在章魚堿型中有Vir F、Vir H，在胭脂堿型中有Tzs。

　　Vir H：對植物產生的某些殺菌或抑菌化合物起解毒作用，從而使自身生不受抑制，可增強致瘤能力。

　　Vir F：編碼一個23KD蛋白，通過Vir 系統傳遞到植物細胞中，對T-DNA起運輸作用。

　　Tzs：大部分胭脂堿型菌株的Ti質粒上均有Tzs基因，轉運玉米素合成酶基因，在細菌中表達后將玉米素分泌到細胞外。該細胞分裂素被植物吸收后，能促進農桿菌感染部位的植物組織脫分化和細胞分裂，提高植物對農桿菌轉化的感受性。