下面是小編搜集整理的植物基因工程課件，希望對大家有幫助！

　　植物基因工程課件

　　（1）植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的條件

　　（2）植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的類型和特性。

　　（3）植物基因工程載體的種類和特性

　　（4）根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能：T-DNA、Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能。

　　（5）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒基因轉(zhuǎn)化機(jī)理

　　（6）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的改造及載體構(gòu)建

　　（7）載體構(gòu)建中常用的選擇標(biāo)記及報(bào)告基因

　　（8）根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化程序及操作原理

　　（9）外源基因在植物中的表達(dá)

　　了解植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的類型、特性掌握Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能，植物載體構(gòu)建原理，植物基因工程常用的載體類型。

重點(diǎn)

　　根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化的原理和方法

難點(diǎn)

　　植物載體構(gòu)建原理

關(guān)鍵點(diǎn)

　　轉(zhuǎn)基因植物的獲取和檢測

教學(xué)目的和要求

　　教材分析

　　主要教具和設(shè)備材料

　　投影儀、電腦、常規(guī)教學(xué)設(shè)備板書與多媒體授課相結(jié)合

　　教法 思考題

　　1. 植物基因工程載體種類？

　　2. 根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化程序？

心得

　　在自然界的許多雙子葉植物中，常常發(fā)生一種嚴(yán)重危害植物生長的病害——冠癭。已知90多科，600多種雙子葉植物都能感染這種病。一般認(rèn)為單子葉植物和裸子植物對此病不敏感。70年代中期，世界上幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)誘發(fā)腫瘤的根癌農(nóng)桿菌中含有大量的誘瘤質(zhì)粒Ti(tumor-inducing plasmid),且證實(shí)了腫瘤的形成正是由于pTi中的特定片段——T-DNA轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定地整合進(jìn)植物細(xì)胞核基因組中的結(jié)果；由于其上載著的冠癭堿合成基因和激素合成基因表達(dá)，因此分泌冠癭堿并形成腫瘤。人們就把這種冠癭的形成過程稱作天然的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

　　農(nóng)桿菌將自身的DNA插入植物細(xì)胞誘發(fā)腫瘤只對其本身是有益的，重要原因之一是因?yàn)檗r(nóng)桿菌誘發(fā)植物細(xì)胞合成冠癭堿為自己提供食物。植物自身不能利用這種物質(zhì)，只能為它的合成付出代價(jià)，別的細(xì)菌也不能利用它，在自然條件下，只有農(nóng)桿菌能分泌分解冠癭堿的酶，將這些特異產(chǎn)物作為唯一的碳源和氮源來利用。

　　腫瘤的產(chǎn)生是由于T-DNA上的激素合成基因所致，刺激細(xì)胞生長而產(chǎn)生腫瘤，這是T-DNA轉(zhuǎn)入的一個(gè)副產(chǎn)品。

　　Ti質(zhì)粒給自己設(shè)計(jì)出一套為其自身存活的非常優(yōu)秀的進(jìn)化格局：它感染植物細(xì)胞，使之出現(xiàn)愈傷組織增生，后者便產(chǎn)生出供帶有Ti質(zhì)粒的細(xì)菌用作能源、碳源和氮源的冠癭堿；而冠癭堿的產(chǎn)生又可激發(fā)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到原先沒有存在這種質(zhì)粒的土壤農(nóng)桿菌中去，如此周而復(fù)始得到不斷發(fā)展。

　　Ti質(zhì)粒是一類理想的植物基因工程載體，通過它們可以將外源DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞，并再生出能夠表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因植物。 Ti質(zhì)粒還具有若干其他載體所不具備的優(yōu)點(diǎn)：

　　（1）T-DNA能夠進(jìn)行高頻的轉(zhuǎn)移，而且這種轉(zhuǎn)移的DNA通常是以未發(fā)生變化的完整形式整合到植物的核基因組上。

　　（2）Ti質(zhì)粒不存在包裝限制問題，大到50kb的外源DNA也能順利地包裝與轉(zhuǎn)移。

一、植物基因工程載體種類

　　據(jù)載體的功能和構(gòu)建過程，可把有關(guān)載體分為四大類型（九種載體）。 克隆載體、中間載體、卸甲載體、轉(zhuǎn)化載體

　　據(jù)載體的功能和構(gòu)建過程，可把有關(guān)載體分為四大類型，九種載體。

　　1、克隆載體（目的基因的克隆載體）

　　通常由多拷貝的E.coli小質(zhì)粒為載體 功能：保存和克隆目的基因。

　　2、中間載體又分為中間克隆載體和中間表達(dá)載體。

　　中間克隆載體：由大腸桿菌質(zhì)粒插入T-DN段及目的基因、標(biāo)記基因等構(gòu)建而成。

　　功能：構(gòu)建中間表達(dá)載體的基礎(chǔ)。

　　分為：中間粘粒載體、質(zhì)粒粘粒愈合載體、基因標(biāo)記載體。 中間表達(dá)載體：含有植物特異啟動子的中間載體

　　功能：作為構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的質(zhì)粒。

　　3、卸甲載體

　　解除武裝的Ti質(zhì)粒或Ri質(zhì)粒。（onc+ -------- onc-） 功能：作為轉(zhuǎn)化載體的受體質(zhì)粒

　　4、轉(zhuǎn)化載體

　　最后用于目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的載體，亦稱工程載體。 它是由中間表達(dá)載體和卸甲載體構(gòu)建而成。

　　分為一元載體系統(tǒng)（順式載體）和雙元轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)（反式載體）。 一元載體系統(tǒng)包括共整合載體和拼接末端載體（SEV）。

二、根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒

　　1、Ti質(zhì)粒的類型、結(jié)構(gòu)與功能

　　（1）類型

　　Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體以外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子，分子量為95~156 x 106D，約150 ~ 200 Kb長。根據(jù)其誘導(dǎo)的冠癭堿種類不同，Ti質(zhì)粒可分為三類： 章魚堿型（octopine）：pTiAch5, pTiA6NC, pTiB653, pTiAg162 胭脂堿型（nopaline）：pTiT37, pTiT38, pTiC58

　　農(nóng)桿堿型（agropine）和農(nóng)桿堿素型（agrocinopine）或琥珀堿型（succinamopine）

　　（2）結(jié)構(gòu)和功能

　　各種Ti質(zhì)粒都可分為四個(gè)區(qū)：

　　①T-DNA區(qū)（transferred-DNA regions）：是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA。該DN段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。

　　②Vir區(qū)（Virulence region）：該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。T-DNA區(qū)與vir區(qū)在質(zhì)粒上彼此相鄰，合起來約占Ti質(zhì)粒DNA的1/3。

　　③Con區(qū)（region of replication）：質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移位點(diǎn)編碼區(qū)，該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此，稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。

　　④Ori區(qū)（origin of replication）：該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，稱之為復(fù)制起始區(qū)。

　　3種成分與Ti質(zhì)粒腫瘤誘導(dǎo)有關(guān):

　　T-DNA：它可轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞，是一種可移動因子。

　　毒性區(qū)：vir基因可產(chǎn)生轉(zhuǎn)移活動蛋白，對增強(qiáng)植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是必須的。 土壤農(nóng)癌桿菌染色體基因:間接參與轉(zhuǎn)化，負(fù)責(zé)將細(xì)菌細(xì)胞接合于植物上。

　　2、T-DNA的基因結(jié)構(gòu)和功能

　　（1）T-DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 長約23Kb

　　在T-DNA的5’和3’端都有真核表達(dá)信號，如TATAbox，AATAAbox及polyA等。

　　T-DNA的兩端左右邊界各為25bp的重復(fù)序列，即邊界序列，分別稱之為左邊界（BL或TL）和右邊界（BR或TR）。該25bp邊界序列屬保守序列（TGACACGATATAT TGGCGGGTAAAC）。通常右邊界序列更為保守，左邊界在某些情況下有所變化。左邊界的缺失突變?nèi)阅苤铝觯疫吔缛笔t不致瘤，這時(shí)幾乎完全沒有T-DNA的轉(zhuǎn)移，這說明右邊界在T-DNA的轉(zhuǎn)移中的重要性。

　　胭脂堿型腫瘤，為一連續(xù)的一段序列，長約23.4Kb，有腫瘤系，僅一個(gè)拷貝，有的T-DNA是多拷貝的。

　　章魚堿型腫瘤：T-DNA分左右兩部分（TL-DNA和TR-DNA），各自帶有左右邊界序列。左區(qū)的順序變化不大，長度約13Kb，通常一個(gè)拷貝，但也有幾個(gè)拷貝首尾相連排列。含章魚堿合成酶基因和致瘤基因。TR-DNA較短，長約6-7Kb，拷貝數(shù)達(dá)數(shù)個(gè) 或數(shù)十個(gè)，有的腫瘤系中沒有TR-DNA。TR-DNA編碼5個(gè)基因，如甘露堿和冠癭堿合成酶基因。

　　（2）T-DNA上的編碼基因及功能

　　章魚堿型和胭脂堿型T-DNA的轉(zhuǎn)錄有下述共同特點(diǎn)： T-DNA的兩條鏈都是有意義鏈；

　　T-DNA上每個(gè)基因都有各自的啟動子； 基因的轉(zhuǎn)錄由植物細(xì)胞RNA聚合酶II完成；

　　T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和終止的調(diào)節(jié)信號，在其5’端轉(zhuǎn)錄起始處有TATA和CAAT盒。另外，至少在5個(gè)T-DNA基因中發(fā)現(xiàn)有一個(gè)8bp的相同順序（TTTCAA GA），同時(shí)AATAAA加尾信號也在同一條鏈上發(fā)現(xiàn)。

　　植物或農(nóng)桿菌中可能有甲基化或去甲基化的調(diào)節(jié)基因活性。 3、Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能

　　毒性區(qū)的大多數(shù)基因產(chǎn)物都控制T-DNA的轉(zhuǎn)移，這個(gè)區(qū)域的突變往往導(dǎo)致農(nóng)桿菌感染植物能力的下降。

　　（1）Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)

　　章魚堿型Ti質(zhì)粒：Vir區(qū)大小為40kb，含有VirA、B、C、D、E、F、G、H（PinF）等8個(gè)操縱子，共24個(gè)基因。大多數(shù)操縱子含有多個(gè)基因VirA（1）、VirB（11）、VirC（2）、VirD（4）VirE（2）、VirF（1）、VirH（2）。

　　胭脂堿型Ti：有7個(gè)操縱子，少一個(gè)VirF，它們的第一個(gè)操縱子也不同，章魚堿型Ti是VirH，而胭脂堿型Ti是Tzs，其功能也不同。 Vir區(qū)基因的表達(dá)有兩種方式：

　　組成型表達(dá)；在無植物誘導(dǎo)分子存在下依然保持一定的表達(dá)水平，virA，virG、virH 誘導(dǎo)型表達(dá)：這些基因的表達(dá)必須在土壤農(nóng)桿菌感染植物時(shí)，在植物受傷組織分泌的信號分子作用下才能啟動表達(dá)，如virB、C、D、E

　　virG雖屬于組成型表達(dá)，但有植物信號分子存在下表達(dá)量提高10倍，也具誘導(dǎo)表達(dá)特性。

　　（2）Vir區(qū)操縱子的基因的功能

　　①Vir A 單個(gè)基因，2.4kb，僅編碼一條多肽。Vir A編碼一種結(jié)合在膜上的化學(xué)受體蛋白（92KD），可直接對植物產(chǎn)生的酚類化合物感應(yīng)，是一種感應(yīng)蛋白。

　　Vir A的活化：當(dāng)AS與Vir A的受體部分結(jié)合后，會使整個(gè)Vir A蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，其C端活化。Vir A蛋白的胞質(zhì)區(qū)有自激酶的功能，可在保守的組氨酸殘基上磷酸化，從而Vir A蛋白被激活。激活后的Vir A具有轉(zhuǎn)移其磷酸基至Vir G蛋白的一個(gè)宿存的天冬氨酸殘基的能力，使Vir G蛋白激活。

　　②Vir G Vir G ，只有1Kb，單基因，編碼DNA結(jié)合蛋白,其C端有DNA結(jié)合活性，N端具有磷酸化的酸性結(jié)構(gòu)。

　　從總體效應(yīng)講，Vir G基因是屬于組成型表達(dá)的，這對于細(xì)菌迅速地將外部環(huán)境信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)十分有利。

　　當(dāng)磷酸化的A蛋白將其磷酸基轉(zhuǎn)到Vir G保守的天冬氨酸殘基上時(shí)，使Vir G蛋白活化，活化Vir G蛋白可以二體或多體形式結(jié)合到Vir啟動子的特定區(qū)，從而成為其它Vir 基因轉(zhuǎn)錄的激活因 子，打開Vir B、C、D、E、H等幾個(gè)基因。Vir A或G突變后會減弱或完全失去對其他Vir 位點(diǎn)活化的誘導(dǎo)，VirA及 Vir G 的這種調(diào)控作用被稱為雙因子調(diào)控體系。 ?Vir H、Vir F及Tzs

　　這些基因?qū)|(zhì)粒是特異的，在章魚堿型中有Vir F、Vir H，在胭脂堿型中有Tzs。

　　Vir H：對植物產(chǎn)生的某些殺菌或抑菌化合物起解毒作用，從而使自身生不受抑制，可增強(qiáng)致瘤能力。

　　Vir F：編碼一個(gè)23KD蛋白，通過Vir 系統(tǒng)傳遞到植物細(xì)胞中，對T-DNA起運(yùn)輸作用。

　　Tzs：大部分胭脂堿型菌株的Ti質(zhì)粒上均有Tzs基因，轉(zhuǎn)運(yùn)玉米素合成酶基因，在細(xì)菌中表達(dá)后將玉米素分泌到細(xì)胞外。該細(xì)胞分裂素被植物吸收后，能促進(jìn)農(nóng)桿菌感染部位的植物組織脫分化和細(xì)胞分裂，提高植物對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的感受性。