這是亞歷山大東征過程中的一次重要作戰，發生在公元前 333年10月，是由波斯國王大流士三世親率大軍襲擊希臘遠征軍時進行的。對于前一年波斯軍在格拉尼庫斯河作戰中的大敗，波斯王很不服氣，他在獲得戰敗的消息后，預計亞歷山大還將繼續東進，于是開始整軍備戰，把國內各部族的部隊陸續調來首都蘇薩城，準備迎擊亞歷山大的遠征軍，期望與他一決雌雄。公元前333年7月，亞歷山大率軍進占西里西亞關口，打開了傳統所說的“通向亞洲的大門”。

　　但他沒有繼續東進到波斯腹地去同大流士決戰，而是率軍南下敘利亞，先去奪取波斯的屬地腓尼基和阿拉伯地區，并消滅波斯海軍，解除自己后方的威脅。然而就在此時，大流士三世已經率領著浩浩蕩蕩的16萬大軍從東北方向開進過來了。波斯軍有正規軍大約十萬人、從各行省各部族調來的雜牌部隊六萬余人，裝備有大批的戰車和輜重車，以及隨軍而來的由御林軍護衛的王室車隊。10月，當亞歷山大率軍穿越伊蘇斯平原進入伊蘇斯城(今土耳其漢杰附近)時，波斯軍也已進到了距離伊蘇斯不遠的索契。但由于交通和通訊的不便，起初彼此都末發覺。波斯王在亞歷山大率軍離開伊蘇斯城不久，終于獲得了敵軍占領伊蘇斯的確實消息，于是決定跟蹤追擊，揮軍進入伊蘇斯，并慘殺了留在那里的所有希臘傷病人員。亞歷山大在行軍途中獲得波斯軍進占伊蘇斯的消息，也立即決定回師，盡管他當時手中的兵力有限，總共只有步兵 2萬余人、騎兵大約3000人，仍然采取主動進攻的態勢。于是，雙方便在皮納魯斯河南北兩岸擺開陣勢，各自搶占高地，展開了名垂史冊的伊蘇斯會戰。

　　大流士三世仗著巨大的兵力優勢，從容地在河的北岸布陣，憑河之險，以逸待勞，指望首先重挫敵軍銳氣而后予以殲滅。亞歷山大率先來到前線，觀察了北岸敵軍陣勢，立即命令主力騎兵迅速涉水過河，猛沖波斯軍在岸邊的守衛部隊，打敵人一個措手不及。他自己也尾隨騎兵過河，直接在現場指揮作戰。交戰展開后，亞歷山大親率右翼騎兵猛沖，突擊波斯軍左翼的步兵方陣，一直逼進到大流士三世的主營附近。當時，波斯軍的中央步兵方陣，主要是由希臘雇傭兵組成的，戰斗力相當強大，曾給馬其頓軍造成較大損失。正在勝負難分之時，亞歷山大敏銳地發現了敵騎兵向外側移動時，與方陣之間出現了一個缺口，他立即親率精銳騎兵直接插入缺口，迅猛奔襲大流士三世立馬的指揮高地。缺乏作戰指揮經驗的波斯國王，因見左翼潰敗而心慌意亂，以為就要遭擒，于是率先棄陣逃走。波斯軍頓失指揮，群龍無首，導致了全線的崩潰。在這次會戰中，波斯軍損失步、騎兵近10萬人，幾乎丟棄了全部輜重、車輛，大流士三世的母親、妻子和兩個女兒及整個王室車隊，全被亞歷山大俘獲。希臘遠征軍又一次創造了以少勝多的奇跡，總共只傷亡約5000人。通過這一戰，亞歷山大完全打開了通向腓尼亞與敘利亞的門戶。