紫心甘薯多糖的分離及組分抑癌活性研究的論文

　　天然活性多糖是一類結構復雜的生物大分子物質，作為植物細胞壁的結構成分廣泛存在于自然界中，具有機體免疫調節、抗氧化、降血糖血脂等作用近年來，多糖研究日益受到人們的關注。目前，實驗室常用熱水浸提和低溫堿提兩種方法來獲得天然活性多糖，如香菇多糖,海藻多糖等M。已有研究表明，采用熱水浸提所得的天然植物多糖（如人參多糖）經純化在體內外均具有一定的抗腫瘤活性0,也有報道紫心甘薯水提粗多糖在體內有一定的抑瘤效果,但尚未見到關于紫心甘薯多糖分離及組分抑癌研究的相關報道。本研究結合浙江省臨安市太陽鎮紫心甘薯基地的開發課題，以紫心甘薯“渝紫263”為材料,通過低溫堿提獲得紫心甘薯粗多糖,研究紫心甘薯多糖組分的分離條件,并借助體外細胞實驗和紅外光譜等檢測手段初步探究紫心甘薯多糖的結構成分及組分的抑癌作用，為進一步開發和利用紫心甘薯提供理論指導和實驗依據。

1材料與方法

　　1.1材料

　　1.1.1實驗材料與試劑紫心甘薯，由浙江省臨安市太陽鎮紫心甘薯實驗基地提供;腫瘤細胞株Hela、HepG:,由浙江大學醫學院提供；DEAE-Cellulose,華東醫藥試劑；CM-Cellulose,華東醫藥試劑；SephacrylS-t00,美國GE公司;D-葡萄糖醛酸，國藥集團試劑；咔唑，中國遠航試劑;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI1640培養基，Hyclone公司；MTT,Sigma公司（臨用時用PBS配置成5mg/ml溶液，分裝避光-20°C保存）；DMSO,Sigma公司；

　　標準單糖（葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖）、NaCl、苯酚、濃硫酸、甲苯胺藍等試劑均為國產分析純。

　　1.1.2主要儀器AKTAprimeplus層析系統，美國GE公司；LDR44.4C低速冷凍離心機，北京醫用離心機廠；高速冷凍離心機,BECKMANCOULTER；可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；RE-2000旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠；電子天平，德國IKA;磁力攪拌器，IKARHbasicl;紅外光譜儀470FT-IR,NEXUS公司；倒置顯微鏡，OLYMPUS；二氧化碳培養箱，美國FormaScientific公司；516MC酶標儀，國產;各種尺寸層析柱，上海華美實驗儀器廠;薄層層析硅膠板,浙江臺州；真空干燥裝置,上海一恒科技有限公司；層析缸，國產。

　　1.2方法

　　1.2.1紫心甘薯多糖提取參見文獻0。甘薯洗凈、去皮、烘干后粉碎；用3倍體積95%乙醇于80C水浴中回流脫脂2h,重復一次，晾干后在70C水浴中水提2h,離心分離上清液,殘渣重復操作一次;合并上清液，濃縮,三氯乙酸法除蛋白，用3倍體積85%乙醇沉淀多糖；無水乙醇、丙酮反復洗滌；將沉淀在低溫下用10%NaOH以1:10的比例進行堿提，濃縮，蒸餾水透析48h;用3倍體積85%乙醇沉淀多糖；離心取沉淀，用無水乙醇反復洗滌；真空烘干后得PPSP粗多糖。

　　1.2.2多糖標準曲線繪制苯酚4硫酸法檢測糖含量，以葡萄糖為標準單糖,繪制葡萄糖標準曲線;硫酸咔唑法檢測糖醛酸含量，以葡萄糖醛酸為標準品,繪制糖醛酸含量測定標準曲線。1.2.3離子交換層析參見文獻_。離子交換柱的選擇：配置0.05mol/LPBS緩沖液（K2HPO4-CH2PO4),再用此緩沖液配置0.5mol/LNaCl溶液,用0.45^m纖維素微孔濾膜過濾，超聲脫氣30min。將處理好的DEAE~Cellulose和CM-Cellulose分別裝柱（2.6X30cm),用3倍柱體積的緩沖液平衡。取PPSP粗多糖，用去離子水配置成5mg/ml的PPSP多糖溶液,分別上樣10ml,待吸附30min后，用相同體積的去離子水分別洗脫,流速1ml/min,每管10ml收集,苯酚^硫酸法檢測,記錄并作洗脫曲線。

　　洗脫液pH的選擇：選用上述吸附效果較好的柱子，取50mgPPSP粗多糖3份,分別溶于10ml的pH7.2、H7.6、H8.1和pH8.6的PBS緩沖液中，經0.45^m濾膜過濾，緩慢上樣，吸附30min后，用200ml對應pH緩沖液洗脫，流速1.0ml/min,每管10ml,苯酚~硫酸法檢測，記錄并作洗脫曲線。

　　洗脫方式的選擇：確定交換柱與pH緩沖體系之后，探究不同洗脫方式對PPSP洗脫效果的影響。取5mg/ml多糖溶液10ml,濾膜過濾,緩慢上樣，吸附30min。先后分別用蒸餾水、0.05mol/LpH7.6的PBS緩沖液結合0.1、.3、.5mol/LNaCl分段洗脫。流速1.0ml/min,每管10ml,分別收集。苯酚~硫酸法測定,作洗脫曲線，合并主要峰，透析除鹽，濃縮，冷凍烘干待用。

　　1.2.4多糖收集和檢測利用美國GE公司蛋白純化儀自動收集器收集離子交換層析的洗脫液,采用苯酚4硫酸法跟蹤檢測各PPSP多糖組分（od490),以管號為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制洗脫曲線，收集同種多糖組分。雙蒸水透析48h,每12h換一次水,磁力攪拌。透析完畢,冷凍干燥得各多糖組分。

　　1.2.5凝膠過濾層析將處理好的SephcrylS400裝柱（屮2.6X30cm),用0.05mol/L的.NaCl平衡,流速0.5ml/min。上述分離得到的樣品溶于0.05mol/L的NaCl溶液中，濾膜過濾后取5ml緩慢上樣，用0.05mol/L的NaCl溶液150ml洗脫，流速0.5ml/min,每管5ml分部收集,苯酚4硫酸法檢測,作洗脫曲線圖。

　　1.2.6薄層層析樣品處理:取紫心甘薯多糖樣品，按多糖：硫酸=4:1的比例加入6mol/L的％SO4,密封90C水解6h,碳酸鋇中和，離心去沉淀。取葡萄糖、糖醛酸、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖等標準單糖做同樣處理。待硅膠板活化后，用毛細管進行點樣。展層劑:正丁醇：乙酸乙酯：異丙醇：乙酸:水=7:20:12:7:5;顯色劑:苯胺4卩苯二甲酸。

　　1.2.7紅外光譜鑒定取約1mg已純化的PPSP多糖組分樣品，與適量KBr粉末在白熾燈下干燥磨混均勻，壓片機壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀在4000cm-1~400cm-1區間掃描。

　　1.2.8MTT法檢測PPSP多糖組分對Hela和HepG2腫瘤細胞的體外抑制作用參見文獻。取對數生長期的Hela和HepG細胞，分別用胰蛋白酶消化后接種于96孔板中。設置不同PPSP多糖組分濃度的實驗組，將標準葡萄糖和PPSPI、PPSPn、PPSPM三種多糖組分臨用前用PBS配置成終濃度為10、20、40、80^g/ml溶液,紫外滅菌。每個實驗組的各濃度梯度組,每孔加上述多糖組分溶液20空白對照組加入相同體積的PBS,每組設4個復孔，置于37C,5%CO2培養箱培養。在加樣后第24、8、96h時各取一塊96孔板，加入20^lMTT溶液繼續培養4h。小心吸盡培養液，加入200^lDMSO,震蕩,使藍紫色結晶物充分溶解,于490nm波長下測各孔吸光度。腫瘤細胞抑制率公式:抑制率IR(%)=(1-A實驗組/A空白對照組）x100%。

　　1.3數據處理采用SPSS18.0進行數據處理和分析,實驗數據取三次平均值,采用方差分析（F檢驗）,有顯著差異時，再作共同對照t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。