紫心甘薯多糖的分離及組分抑癌活性研究的論文

　　天然活性多糖是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子物質(zhì)，作為植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分廣泛存在于自然界中，具有機體免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖血脂等作用近年來，多糖研究日益受到人們的關(guān)注。目前，實驗室常用熱水浸提和低溫堿提兩種方法來獲得天然活性多糖，如香菇多糖,海藻多糖等M。已有研究表明，采用熱水浸提所得的天然植物多糖（如人參多糖）經(jīng)純化在體內(nèi)外均具有一定的抗腫瘤活性0,也有報道紫心甘薯水提粗多糖在體內(nèi)有一定的抑瘤效果,但尚未見到關(guān)于紫心甘薯多糖分離及組分抑癌研究的相關(guān)報道。本研究結(jié)合浙江省臨安市太陽鎮(zhèn)紫心甘薯基地的開發(fā)課題，以紫心甘薯“渝紫263”為材料,通過低溫堿提獲得紫心甘薯粗多糖,研究紫心甘薯多糖組分的分離條件,并借助體外細(xì)胞實驗和紅外光譜等檢測手段初步探究紫心甘薯多糖的結(jié)構(gòu)成分及組分的抑癌作用，為進(jìn)一步開發(fā)和利用紫心甘薯提供理論指導(dǎo)和實驗依據(jù)。

1材料與方法

　　1.1材料

　　1.1.1實驗材料與試劑紫心甘薯，由浙江省臨安市太陽鎮(zhèn)紫心甘薯實驗基地提供;腫瘤細(xì)胞株Hela、HepG:,由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供；DEAE-Cellulose,華東醫(yī)藥試劑；CM-Cellulose,華東醫(yī)藥試劑；SephacrylS-t00,美國GE公司;D-葡萄糖醛酸，國藥集團試劑；咔唑，中國遠(yuǎn)航試劑;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基，Hyclone公司；MTT,Sigma公司（臨用時用PBS配置成5mg/ml溶液，分裝避光-20°C保存）；DMSO,Sigma公司；

　　標(biāo)準(zhǔn)單糖（葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖）、NaCl、苯酚、濃硫酸、甲苯胺藍(lán)等試劑均為國產(chǎn)分析純。

　　1.1.2主要儀器AKTAprimeplus層析系統(tǒng)，美國GE公司；LDR44.4C低速冷凍離心機，北京醫(yī)用離心機廠；高速冷凍離心機,BECKMANCOULTER；可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠；電子天平，德國IKA;磁力攪拌器，IKARHbasicl;紅外光譜儀470FT-IR,NEXUS公司；倒置顯微鏡，OLYMPUS；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國FormaScientific公司；516MC酶標(biāo)儀，國產(chǎn);各種尺寸層析柱，上海華美實驗儀器廠;薄層層析硅膠板,浙江臺州；真空干燥裝置,上海一恒科技有限公司；層析缸，國產(chǎn)。

　　1.2方法

　　1.2.1紫心甘薯多糖提取參見文獻(xiàn)0。甘薯洗凈、去皮、烘干后粉碎；用3倍體積95%乙醇于80C水浴中回流脫脂2h,重復(fù)一次，晾干后在70C水浴中水提2h,離心分離上清液,殘渣重復(fù)操作一次;合并上清液，濃縮,三氯乙酸法除蛋白，用3倍體積85%乙醇沉淀多糖；無水乙醇、丙酮反復(fù)洗滌；將沉淀在低溫下用10%NaOH以1:10的比例進(jìn)行堿提，濃縮，蒸餾水透析48h;用3倍體積85%乙醇沉淀多糖；離心取沉淀，用無水乙醇反復(fù)洗滌；真空烘干后得PPSP粗多糖。

　　1.2.2多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制苯酚4硫酸法檢測糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)單糖,繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線;硫酸咔唑法檢測糖醛酸含量，以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制糖醛酸含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.3離子交換層析參見文獻(xiàn)_。離子交換柱的選擇：配置0.05mol/LPBS緩沖液（K2HPO4-CH2PO4),再用此緩沖液配置0.5mol/LNaCl溶液,用0.45^m纖維素微孔濾膜過濾，超聲脫氣30min。將處理好的DEAE~Cellulose和CM-Cellulose分別裝柱（2.6X30cm),用3倍柱體積的緩沖液平衡。取PPSP粗多糖，用去離子水配置成5mg/ml的PPSP多糖溶液,分別上樣10ml,待吸附30min后，用相同體積的去離子水分別洗脫,流速1ml/min,每管10ml收集,苯酚^硫酸法檢測,記錄并作洗脫曲線。

　　洗脫液pH的選擇：選用上述吸附效果較好的柱子，取50mgPPSP粗多糖3份,分別溶于10ml的pH7.2、H7.6、H8.1和pH8.6的PBS緩沖液中，經(jīng)0.45^m濾膜過濾，緩慢上樣，吸附30min后，用200ml對應(yīng)pH緩沖液洗脫，流速1.0ml/min,每管10ml,苯酚~硫酸法檢測，記錄并作洗脫曲線。

　　洗脫方式的選擇：確定交換柱與pH緩沖體系之后，探究不同洗脫方式對PPSP洗脫效果的影響。取5mg/ml多糖溶液10ml,濾膜過濾,緩慢上樣，吸附30min。先后分別用蒸餾水、0.05mol/LpH7.6的PBS緩沖液結(jié)合0.1、.3、.5mol/LNaCl分段洗脫。流速1.0ml/min,每管10ml,分別收集。苯酚~硫酸法測定,作洗脫曲線，合并主要峰，透析除鹽，濃縮，冷凍烘干待用。

　　1.2.4多糖收集和檢測利用美國GE公司蛋白純化儀自動收集器收集離子交換層析的洗脫液,采用苯酚4硫酸法跟蹤檢測各PPSP多糖組分（od490),以管號為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線，收集同種多糖組分。雙蒸水透析48h,每12h換一次水,磁力攪拌。透析完畢,冷凍干燥得各多糖組分。

　　1.2.5凝膠過濾層析將處理好的SephcrylS400裝柱（屮2.6X30cm),用0.05mol/L的.NaCl平衡,流速0.5ml/min。上述分離得到的樣品溶于0.05mol/L的NaCl溶液中，濾膜過濾后取5ml緩慢上樣，用0.05mol/L的NaCl溶液150ml洗脫，流速0.5ml/min,每管5ml分部收集,苯酚4硫酸法檢測,作洗脫曲線圖。

　　1.2.6薄層層析樣品處理:取紫心甘薯多糖樣品，按多糖：硫酸=4:1的比例加入6mol/L的％SO4,密封90C水解6h,碳酸鋇中和，離心去沉淀。取葡萄糖、糖醛酸、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖等標(biāo)準(zhǔn)單糖做同樣處理。待硅膠板活化后，用毛細(xì)管進(jìn)行點樣。展層劑:正丁醇：乙酸乙酯：異丙醇：乙酸:水=7:20:12:7:5;顯色劑:苯胺4卩苯二甲酸。

　　1.2.7紅外光譜鑒定取約1mg已純化的PPSP多糖組分樣品，與適量KBr粉末在白熾燈下干燥磨混均勻，壓片機壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀在4000cm-1~400cm-1區(qū)間掃描。

　　1.2.8MTT法檢測PPSP多糖組分對Hela和HepG2腫瘤細(xì)胞的體外抑制作用參見文獻(xiàn)。取對數(shù)生長期的Hela和HepG細(xì)胞，分別用胰蛋白酶消化后接種于96孔板中。設(shè)置不同PPSP多糖組分濃度的實驗組，將標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖和PPSPI、PPSPn、PPSPM三種多糖組分臨用前用PBS配置成終濃度為10、20、40、80^g/ml溶液,紫外滅菌。每個實驗組的各濃度梯度組,每孔加上述多糖組分溶液20空白對照組加入相同體積的PBS,每組設(shè)4個復(fù)孔，置于37C,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在加樣后第24、8、96h時各取一塊96孔板，加入20^lMTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸盡培養(yǎng)液，加入200^lDMSO,震蕩,使藍(lán)紫色結(jié)晶物充分溶解,于490nm波長下測各孔吸光度。腫瘤細(xì)胞抑制率公式:抑制率IR(%)=(1-A實驗組/A空白對照組）x100%。

　　1.3數(shù)據(jù)處理采用SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析,實驗數(shù)據(jù)取三次平均值,采用方差分析（F檢驗）,有顯著差異時，再作共同對照t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。