在生理狀態(tài)下, 細胞通過自噬 (autophagy) 清除衰老細胞器和突變蛋白, 以維持自身結構穩(wěn)定和功能正常。自噬還參與胚胎發(fā)育、免疫調節(jié)等生理過程。病理狀態(tài)下細胞自噬水平顯著升高, 以耐受缺血、饑餓和凋亡等情況。此外, 自噬功能的障礙還會導致某些疾病的發(fā)生。根據(jù)細胞內底物運送到溶酶體腔的方式不同, 自噬可分為大自噬 (macroautophagy)、小自噬 (microautophagy) 、分子伴侶介導的自噬(chaperon-mediated autophagy, CMA)。此外, 還有些選擇性自噬如線粒體自噬 (mitophagy)、聚集體自噬 (aggrephagy)等。不同類型的自噬其發(fā)生過程不同,參與的蛋白分子也不同。檢測不同自噬過程中的分子標志物的水平、狀態(tài)與定位有助于評價細胞的自噬水平。

　　1 大自噬標志物

　　大自噬的囊泡膜結構起源于內質網(wǎng)和高爾基體等。這些膜片段形成杯狀結構, 包裹胞內物質并最終形成閉合的雙層膜的囊泡即自噬體, 然后自噬體與溶酶體融合, 自噬體內蛋白質或細胞器在溶酶體中被溶酶體酶降解。因此該過程的標志物包括自噬體囊泡形成過程的標志物、溶酶體標志物和自噬底物標志物三類。

　　1.1 自噬體標志物

　　自噬相關蛋白 (autophagy-related protein, Atg)是一類自噬組成蛋白, 參與調節(jié)自噬起始和延伸等過程。其中幾個關鍵蛋白, 也成為自噬標志物。

　　1.1.1 Atg12-Atg5 復合物Atg12 與Atg5 會形成復合物, 甚至在一些哺乳動物細胞中似乎所有Atg5和Atg12都表現(xiàn)為結合體的形式。Atg12-Atg5 復合物在自噬的形成中至關重要。此外, Atg12-Atg5 復合物還可以充當Atg8-磷脂酰乙醇胺 (phosphatidylethanolamine,PE) 結合系統(tǒng)的E3 樣連接酶。Atg12-Atg5 的缺失會導致自噬缺陷。但在短時饑餓狀態(tài), Atg12-Atg5 的水平改變并不明顯。Atg12-Atg5 復合物的水平檢測可采用蛋白質印跡技術 (Western blot) 方法進行。Atg12 分子質量預期為15 kDa, 但在SDS-PAGE 膠上目測大約在19 kDa的位置上。Atg5 分子質量大約為32 kDa。由于Atg12分子質量小, 不易檢測, 并且Atg5 與Atg12 的結合是非可逆的, 因此可分別用Atg5 和Atg12 的抗體孵育,然后直接檢測Atg12-Atg5 的結合形式, 其分子質量大約在55 kDa 左右。

　　1.1.2 自噬相關16 樣蛋白1 (autophagy related 16-like 1, Atg16L1) Atg16L1 與Atg12-Atg5 復合物相互作用, 并以自身寡聚化的方式形成Atg12-Atg5-Atg16L1 復合物 , 附著在自噬體表面, 在自噬前體膜的延伸中發(fā)揮作用。在自噬前體膜完全融合形成封閉的自噬體后, Atg12-Atg5-Atg16L1 復合物被釋放到胞質中。在細胞膜轉移作為自噬膜供體的過程中, Atg16L1 可作為一個指標, 其定位在自噬體上,但在完整的自噬溶酶體膜上尚未見分布。因此,Atg16L1 可以用來檢測早期自噬體的形成。可對Atg5、Atg12 或Atg16L1 進行免疫透射電鏡和免疫染色的檢測。檢測內源性的Atg5、Atg12 或Atg16L1 所形成的點狀聚集或斑塊可監(jiān)測自噬的改變。在生理情況下, 內源性蛋白主要是在胞漿中彌散分布的; 而在饑餓等環(huán)境應激下自噬被誘導, 則細胞中Atg5、Atg12 或Atg16L1 的點狀聚集或斑塊會明顯增加。

　　1.1.3 Atg8/微管相關蛋白1 輕鏈3 (microtubuleassociatedprotein1 light chain 3, LC3) Atg8/LC3是目前研究中被最廣泛使用的分子標志物。在酵母中, Atg8 與PE 偶聯(lián)形成Atg8-PE[5]。LC3 參與了自噬體膜的形成, 包括兩種可相互轉化的形式即LC3-I 和LC3-II。細胞內新合成的LC3 經過加工, 成為胞漿可溶形式的LC3-I, 后者經泛素化加工修飾, 與自噬體膜表面的PE 結合, 成為膜結合形式的LC3-II。LC3-II定位于前自噬體和自噬體, 是自噬體的標志分子, 隨自噬體膜的增多而增加。SDS-PAGE 電泳中, LC3-I 的表觀分子質量為18 kDa, LC3-II 的表觀分子質量為16 kDa。盡管PE偶聯(lián)形式的LC3-II 的分子質量較LC3-I 大, 但是其具有強疏水性, 因此在SDS-PAGE 中電泳遷移率反而比LC3-I (非PE 偶聯(lián)的LC3) 快。可以通過Western blot比較組間LC3-II 水平, 也可通過計算LC3-II/LC3-I的比值來評價LC3-II 水平, 并推測自噬囊泡數(shù)量的多少。LC3 在含SDS 的樣品裂解液中易降解, 因此樣品經煮沸裂解后應當盡快進行Western blot 實驗, 并避免反復凍融。LC3-II 的含量或LC3-II/LC3-I 的比例與自噬體的數(shù)量呈正相關, 在某種程度上反映了細胞的自噬活性。但是需要注意的是, 自噬是動態(tài)的, 自噬體的聚集可能是自噬活化待降解底物聚集而成, 也可能是自噬效應部分阻斷, 自噬體無法被清除導致的。因此僅評價自噬體數(shù)量或LC3-II 的表達均不能代表整個自噬過程。只有客觀地分析自噬動態(tài)變化才能準確地判斷自噬活性。基于自噬流 (autophagic flux) 的檢測成為反映自噬活性更為可靠的指標。

　　1.1.4 Atg9/mAtg9 Atg9 是所有Atg 蛋白中唯一的跨膜蛋白, 進化上高度保守, 在酵母以及哺乳動物細胞中都存在。酵母Atg9 存在于30～60 nm 的、來源于高爾基體膜的單層囊泡上, 這些Atg9 囊泡在胞漿快速運動, 并整合到自噬囊泡外膜上。哺乳動物細胞mAtg9 與自噬囊泡存在動態(tài)相互作用。在形成成熟自噬體后, mAtg9 并未整合進自噬體囊泡上, 而是又游離進入胞漿。有研究表明, mAtg9 在形成雙FYVE 結構域蛋白1 (double FYVE-containing protein 1, DFCP1)陽性的自噬體前體中是必需的, 但不依賴于早期的一些自噬蛋白如UNC-51 樣激酶1 (UNC-51-like kinase1, ULK1) 和磷酸肌醇相互作用蛋白2 (WD repeatdomain, phosphoinositide-interacting protein 2,WIPI2)。mAtg9 定位在內體和內體樣的部位, 推測其在多種細胞器如再循環(huán)的內體間活動, 在自噬的起始進程中發(fā)揮極為關鍵的作用。mAtg9 可用來檢測自噬的發(fā)生。

　　1.1.5 Atg6/Beclin1 哺乳動物Beclin1 是酵母Atg6/液泡分選蛋白30 (vacuole protein sorting 30,Vps30) 基因的同源物。Beclin1 主要定位于反面高爾基體 (trans-Golgi network, TGN)、內質網(wǎng)和線粒體。Beclin1 與Vps34 形成III 型磷脂酰肌醇3 激酶復合物 (phosphatidylinositol 3-kinase Class IIIcomplex, PI3KC3) 。Vps34 可磷酸化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI) 生成3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3-phosphate, PI3P), 而PI3P 募集胞漿中其他自噬相關蛋白Atg 結合到前自噬體膜上, 在自噬體形成早期發(fā)揮重要作用。磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K) 抑制劑可干擾自噬體的形成。此外, Bcl-2 與Beclin1 結合也可抑制自噬活性。用熒光顯微鏡或透射電鏡可檢測Beclin1-GFP 的點狀聚集或斑塊作為自噬標志物。但Beclin1 自身有核定位信號, 且GFP 融合蛋白的定位受到GFP 的干擾, 因此Beclin1-GFP 熒光顯微結果顯示有核定位傾向, 可能會影響對自噬狀態(tài)的評判。在Beclin1 依賴的自噬中, PI3K 活性在自噬體形成中至關重要, 因此在Beclin1 免疫沉淀物中測定PI3K 活性可用來監(jiān)測其對自噬的調節(jié)影響。

　　1.1.6 Atg14/Barkor Atg14 定位在自噬體上, 其羧基端被命名為BATS (barkor autophagosome targetingsequence) 區(qū)域。BATS 區(qū)域在Beclin1 招募和自噬活化中意義重大。Atg14 的BATS 區(qū)域通過α 螺旋的疏水表面與自噬囊泡膜結合。在應激情況下, BATS 點狀聚集或斑塊與Atg16 和LC3 以及部分自噬早期標志物DFCP1 重合。Atg14-GFP 或BATS-GFP 在用熒光顯微鏡或投射電鏡技術檢測自噬水平時可作為自噬標志物。但除了定位于自噬體, Atg14 也定位于自噬溶酶體和內質網(wǎng)上。因此, 用Atg14 作為標志物時最好也結合用其他自噬標志物做鑒定。

　　1.1.7 損傷調節(jié)自噬蛋白 (damage-regulated autophagymodulator 1, DRAM1) DRAM1 是一個具有六個跨膜結構的疏水蛋白。除了定位于順面高爾基體, DRAM1 也定位于早期和晚期內體和溶酶體, 它與早期核內體相關蛋白1 (early-endosome-associatedprotein 1, EEA1) 和溶酶體相關膜蛋白2 (lysosomeassociatedmembrane protein type 2, LAMP-2) 共定位。在應激情況下, DRAM1 可被活化的p53 激活。DRAM1 基因沉默會阻斷自噬的發(fā)生。由于DRAM1分子質量很小, 大約28 kDa, 加之其疏水性強, 蛋白水平檢測有一定難度, 可考慮用實時定量PCR 對其mRNA 水平進行檢測。

　　1.1.8 ZFYVE1/DFCP1 鋅指FYVE 結構域蛋白1(zinc finger FYVE domain-containing protein 1, ZFYVE1)也被稱為雙FYVE 結構域蛋白1 (DFCP1), 其羧基端即為兩個鋅結合的FYVE 結構域。FYVE 結構域參與膜轉運和細胞信號, 促進其與含PI3P 的膜結合。ZFYVE1/DFCP1 與PI3P 結合后, 定位于內質網(wǎng)和高爾基體。饑餓誘導DFCP1 轉位至粗面內質網(wǎng)的粗粒上, 顯示在歐米茄體 (omegasome) 形成的部位。因此DFCP1 可作為自噬形成初期的標志物。DFCP1的表達可用熒光免疫組化方法觀察, 出現(xiàn)DFCP1 陽性的點狀分布則意味著自噬囊泡正在開始形成期。

　　1.2 溶酶體標志物

　　因為自噬過程最終的完成是在溶酶體中進行的,因此溶酶體標志蛋白在自噬功能研究中就顯得極為重要。在酸性水解酶的作用下, 進入溶酶體的自噬體內容物被降解。降解生成的可溶性小分子物質經自噬溶酶體膜滲透入細胞質, 參與細胞的物質代謝活動。目前已識別的25 個溶酶體膜蛋白都是高糖基化的。含量最高的膜蛋白就是溶酶體相關膜蛋白1(lysosome-associated membrane protein type 1, LAMP-1)、LAMP-2 和溶酶體整合膜蛋白 (lysosomal integralmembrane protein, LIMP-2)。可用免疫組化或Western blot 的方法檢測溶酶體重要膜蛋白的水平,并與其他自噬相關蛋白結合使用。

　　1.3 自噬底物

　　p62 也被稱為SQSTM1, 在多種細胞和組織中都有表達, 可作為一個貨車蛋白參與多種信號轉導過程。p62 可連接LC3 和泛素化的底物, 隨后被整合到自噬體中, 并在自噬溶酶體中被降解。當自噬被激活時自噬體與溶酶體融合, 自噬囊泡中p62 等蛋白或細胞器被溶酶體酶降解, p62 水平降低; 當自噬被抑制時自噬體積累, p62 水平升高。因此, 可以用Western blot 方法檢測p62 的水平, 作為自噬能力變化的指征。

　　除了與LC3 和泛素化蛋白結合外, p62 可能還參與形成雷帕霉素靶蛋白復合物 (target of rapamycincomplex 1, TORC1)。p62 還與蛋白酶體功能相關。當?shù)鞍酌阁w功能被抑制時, p62 水平也會增高。此外,p62 也是鈣依賴的非溶酶體蛋白酶calpain 1 的底物,因此很難解釋它在自噬與死亡檢測中的意義。在自噬被激活時, LC3 的上調和p62 的表達下降不一定有明顯的關聯(lián)。盡管p62 可以作為自噬損害或者自噬流改變的輔助標志, 但最好聯(lián)合其他指標如LC3 進行自噬流的評估。