在生理狀態(tài)下, 細(xì)胞通過(guò)自噬 (autophagy) 清除衰老細(xì)胞器和突變蛋白, 以維持自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能正常。自噬還參與胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等生理過(guò)程。病理狀態(tài)下細(xì)胞自噬水平顯著升高, 以耐受缺血、饑餓和凋亡等情況。此外, 自噬功能的障礙還會(huì)導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)底物運(yùn)送到溶酶體腔的方式不同, 自噬可分為大自噬 (macroautophagy)、小自噬 (microautophagy) 、分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperon-mediated autophagy, CMA)。此外, 還有些選擇性自噬如線粒體自噬 (mitophagy)、聚集體自噬 (aggrephagy)等。不同類型的自噬其發(fā)生過(guò)程不同,參與的蛋白分子也不同。檢測(cè)不同自噬過(guò)程中的分子標(biāo)志物的水平、狀態(tài)與定位有助于評(píng)價(jià)細(xì)胞的自噬水平。

　　1 大自噬標(biāo)志物

　　大自噬的囊泡膜結(jié)構(gòu)起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等。這些膜片段形成杯狀結(jié)構(gòu), 包裹胞內(nèi)物質(zhì)并最終形成閉合的雙層膜的囊泡即自噬體, 然后自噬體與溶酶體融合, 自噬體內(nèi)蛋白質(zhì)或細(xì)胞器在溶酶體中被溶酶體酶降解。因此該過(guò)程的標(biāo)志物包括自噬體囊泡形成過(guò)程的標(biāo)志物、溶酶體標(biāo)志物和自噬底物標(biāo)志物三類。

　　1.1 自噬體標(biāo)志物

　　自噬相關(guān)蛋白 (autophagy-related protein, Atg)是一類自噬組成蛋白, 參與調(diào)節(jié)自噬起始和延伸等過(guò)程。其中幾個(gè)關(guān)鍵蛋白, 也成為自噬標(biāo)志物。

　　1.1.1 Atg12-Atg5 復(fù)合物Atg12 與Atg5 會(huì)形成復(fù)合物, 甚至在一些哺乳動(dòng)物細(xì)胞中似乎所有Atg5和Atg12都表現(xiàn)為結(jié)合體的形式。Atg12-Atg5 復(fù)合物在自噬的形成中至關(guān)重要。此外, Atg12-Atg5 復(fù)合物還可以充當(dāng)Atg8-磷脂酰乙醇胺 (phosphatidylethanolamine,PE) 結(jié)合系統(tǒng)的E3 樣連接酶。Atg12-Atg5 的缺失會(huì)導(dǎo)致自噬缺陷。但在短時(shí)饑餓狀態(tài), Atg12-Atg5 的水平改變并不明顯。Atg12-Atg5 復(fù)合物的水平檢測(cè)可采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù) (Western blot) 方法進(jìn)行。Atg12 分子質(zhì)量預(yù)期為15 kDa, 但在SDS-PAGE 膠上目測(cè)大約在19 kDa的位置上。Atg5 分子質(zhì)量大約為32 kDa。由于Atg12分子質(zhì)量小, 不易檢測(cè), 并且Atg5 與Atg12 的結(jié)合是非可逆的, 因此可分別用Atg5 和Atg12 的抗體孵育,然后直接檢測(cè)Atg12-Atg5 的結(jié)合形式, 其分子質(zhì)量大約在55 kDa 左右。

　　1.1.2 自噬相關(guān)16 樣蛋白1 (autophagy related 16-like 1, Atg16L1) Atg16L1 與Atg12-Atg5 復(fù)合物相互作用, 并以自身寡聚化的方式形成Atg12-Atg5-Atg16L1 復(fù)合物 , 附著在自噬體表面, 在自噬前體膜的延伸中發(fā)揮作用。在自噬前體膜完全融合形成封閉的自噬體后, Atg12-Atg5-Atg16L1 復(fù)合物被釋放到胞質(zhì)中。在細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移作為自噬膜供體的過(guò)程中, Atg16L1 可作為一個(gè)指標(biāo), 其定位在自噬體上,但在完整的自噬溶酶體膜上尚未見(jiàn)分布。因此,Atg16L1 可以用來(lái)檢測(cè)早期自噬體的形成。可對(duì)Atg5、Atg12 或Atg16L1 進(jìn)行免疫透射電鏡和免疫染色的檢測(cè)。檢測(cè)內(nèi)源性的Atg5、Atg12 或Atg16L1 所形成的點(diǎn)狀聚集或斑塊可監(jiān)測(cè)自噬的改變。在生理情況下, 內(nèi)源性蛋白主要是在胞漿中彌散分布的; 而在饑餓等環(huán)境應(yīng)激下自噬被誘導(dǎo), 則細(xì)胞中Atg5、Atg12 或Atg16L1 的點(diǎn)狀聚集或斑塊會(huì)明顯增加。

　　1.1.3 Atg8/微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3 (microtubuleassociatedprotein1 light chain 3, LC3) Atg8/LC3是目前研究中被最廣泛使用的分子標(biāo)志物。在酵母中, Atg8 與PE 偶聯(lián)形成Atg8-PE[5]。LC3 參與了自噬體膜的形成, 包括兩種可相互轉(zhuǎn)化的形式即LC3-I 和LC3-II。細(xì)胞內(nèi)新合成的LC3 經(jīng)過(guò)加工, 成為胞漿可溶形式的LC3-I, 后者經(jīng)泛素化加工修飾, 與自噬體膜表面的PE 結(jié)合, 成為膜結(jié)合形式的LC3-II。LC3-II定位于前自噬體和自噬體, 是自噬體的標(biāo)志分子, 隨自噬體膜的增多而增加。SDS-PAGE 電泳中, LC3-I 的表觀分子質(zhì)量為18 kDa, LC3-II 的表觀分子質(zhì)量為16 kDa。盡管PE偶聯(lián)形式的LC3-II 的分子質(zhì)量較LC3-I 大, 但是其具有強(qiáng)疏水性, 因此在SDS-PAGE 中電泳遷移率反而比LC3-I (非PE 偶聯(lián)的LC3) 快。可以通過(guò)Western blot比較組間LC3-II 水平, 也可通過(guò)計(jì)算LC3-II/LC3-I的比值來(lái)評(píng)價(jià)LC3-II 水平, 并推測(cè)自噬囊泡數(shù)量的多少。LC3 在含SDS 的樣品裂解液中易降解, 因此樣品經(jīng)煮沸裂解后應(yīng)當(dāng)盡快進(jìn)行Western blot 實(shí)驗(yàn), 并避免反復(fù)凍融。LC3-II 的含量或LC3-II/LC3-I 的比例與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān), 在某種程度上反映了細(xì)胞的自噬活性。但是需要注意的是, 自噬是動(dòng)態(tài)的, 自噬體的聚集可能是自噬活化待降解底物聚集而成, 也可能是自噬效應(yīng)部分阻斷, 自噬體無(wú)法被清除導(dǎo)致的。因此僅評(píng)價(jià)自噬體數(shù)量或LC3-II 的表達(dá)均不能代表整個(gè)自噬過(guò)程。只有客觀地分析自噬動(dòng)態(tài)變化才能準(zhǔn)確地判斷自噬活性。基于自噬流 (autophagic flux) 的檢測(cè)成為反映自噬活性更為可靠的指標(biāo)。

　　1.1.4 Atg9/mAtg9 Atg9 是所有Atg 蛋白中唯一的跨膜蛋白, 進(jìn)化上高度保守, 在酵母以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中都存在。酵母Atg9 存在于30～60 nm 的、來(lái)源于高爾基體膜的單層囊泡上, 這些Atg9 囊泡在胞漿快速運(yùn)動(dòng), 并整合到自噬囊泡外膜上。哺乳動(dòng)物細(xì)胞mAtg9 與自噬囊泡存在動(dòng)態(tài)相互作用。在形成成熟自噬體后, mAtg9 并未整合進(jìn)自噬體囊泡上, 而是又游離進(jìn)入胞漿。有研究表明, mAtg9 在形成雙FYVE 結(jié)構(gòu)域蛋白1 (double FYVE-containing protein 1, DFCP1)陽(yáng)性的自噬體前體中是必需的, 但不依賴于早期的一些自噬蛋白如UNC-51 樣激酶1 (UNC-51-like kinase1, ULK1) 和磷酸肌醇相互作用蛋白2 (WD repeatdomain, phosphoinositide-interacting protein 2,WIPI2)。mAtg9 定位在內(nèi)體和內(nèi)體樣的部位, 推測(cè)其在多種細(xì)胞器如再循環(huán)的內(nèi)體間活動(dòng), 在自噬的起始進(jìn)程中發(fā)揮極為關(guān)鍵的作用。mAtg9 可用來(lái)檢測(cè)自噬的發(fā)生。

　　1.1.5 Atg6/Beclin1 哺乳動(dòng)物Beclin1 是酵母Atg6/液泡分選蛋白30 (vacuole protein sorting 30,Vps30) 基因的同源物。Beclin1 主要定位于反面高爾基體 (trans-Golgi network, TGN)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體。Beclin1 與Vps34 形成III 型磷脂酰肌醇3 激酶復(fù)合物 (phosphatidylinositol 3-kinase Class IIIcomplex, PI3KC3) 。Vps34 可磷酸化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI) 生成3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3-phosphate, PI3P), 而PI3P 募集胞漿中其他自噬相關(guān)蛋白Atg 結(jié)合到前自噬體膜上, 在自噬體形成早期發(fā)揮重要作用。磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K) 抑制劑可干擾自噬體的形成。此外, Bcl-2 與Beclin1 結(jié)合也可抑制自噬活性。用熒光顯微鏡或透射電鏡可檢測(cè)Beclin1-GFP 的點(diǎn)狀聚集或斑塊作為自噬標(biāo)志物。但Beclin1 自身有核定位信號(hào), 且GFP 融合蛋白的定位受到GFP 的干擾, 因此Beclin1-GFP 熒光顯微結(jié)果顯示有核定位傾向, 可能會(huì)影響對(duì)自噬狀態(tài)的評(píng)判。在Beclin1 依賴的自噬中, PI3K 活性在自噬體形成中至關(guān)重要, 因此在Beclin1 免疫沉淀物中測(cè)定PI3K 活性可用來(lái)監(jiān)測(cè)其對(duì)自噬的調(diào)節(jié)影響。

　　1.1.6 Atg14/Barkor Atg14 定位在自噬體上, 其羧基端被命名為BATS (barkor autophagosome targetingsequence) 區(qū)域。BATS 區(qū)域在Beclin1 招募和自噬活化中意義重大。Atg14 的BATS 區(qū)域通過(guò)α 螺旋的疏水表面與自噬囊泡膜結(jié)合。在應(yīng)激情況下, BATS 點(diǎn)狀聚集或斑塊與Atg16 和LC3 以及部分自噬早期標(biāo)志物DFCP1 重合。Atg14-GFP 或BATS-GFP 在用熒光顯微鏡或投射電鏡技術(shù)檢測(cè)自噬水平時(shí)可作為自噬標(biāo)志物。但除了定位于自噬體, Atg14 也定位于自噬溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。因此, 用Atg14 作為標(biāo)志物時(shí)最好也結(jié)合用其他自噬標(biāo)志物做鑒定。

　　1.1.7 損傷調(diào)節(jié)自噬蛋白 (damage-regulated autophagymodulator 1, DRAM1) DRAM1 是一個(gè)具有六個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)的疏水蛋白。除了定位于順面高爾基體, DRAM1 也定位于早期和晚期內(nèi)體和溶酶體, 它與早期核內(nèi)體相關(guān)蛋白1 (early-endosome-associatedprotein 1, EEA1) 和溶酶體相關(guān)膜蛋白2 (lysosomeassociatedmembrane protein type 2, LAMP-2) 共定位。在應(yīng)激情況下, DRAM1 可被活化的p53 激活。DRAM1 基因沉默會(huì)阻斷自噬的發(fā)生。由于DRAM1分子質(zhì)量很小, 大約28 kDa, 加之其疏水性強(qiáng), 蛋白水平檢測(cè)有一定難度, 可考慮用實(shí)時(shí)定量PCR 對(duì)其mRNA 水平進(jìn)行檢測(cè)。

　　1.1.8 ZFYVE1/DFCP1 鋅指FYVE 結(jié)構(gòu)域蛋白1(zinc finger FYVE domain-containing protein 1, ZFYVE1)也被稱為雙FYVE 結(jié)構(gòu)域蛋白1 (DFCP1), 其羧基端即為兩個(gè)鋅結(jié)合的FYVE 結(jié)構(gòu)域。FYVE 結(jié)構(gòu)域參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞信號(hào), 促進(jìn)其與含PI3P 的膜結(jié)合。ZFYVE1/DFCP1 與PI3P 結(jié)合后, 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。饑餓誘導(dǎo)DFCP1 轉(zhuǎn)位至粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的粗粒上, 顯示在歐米茄體 (omegasome) 形成的部位。因此DFCP1 可作為自噬形成初期的標(biāo)志物。DFCP1的表達(dá)可用熒光免疫組化方法觀察, 出現(xiàn)DFCP1 陽(yáng)性的點(diǎn)狀分布則意味著自噬囊泡正在開(kāi)始形成期。

　　1.2 溶酶體標(biāo)志物

　　因?yàn)樽允蛇^(guò)程最終的完成是在溶酶體中進(jìn)行的,因此溶酶體標(biāo)志蛋白在自噬功能研究中就顯得極為重要。在酸性水解酶的作用下, 進(jìn)入溶酶體的自噬體內(nèi)容物被降解。降解生成的可溶性小分子物質(zhì)經(jīng)自噬溶酶體膜滲透入細(xì)胞質(zhì), 參與細(xì)胞的物質(zhì)代謝活動(dòng)。目前已識(shí)別的25 個(gè)溶酶體膜蛋白都是高糖基化的。含量最高的膜蛋白就是溶酶體相關(guān)膜蛋白1(lysosome-associated membrane protein type 1, LAMP-1)、LAMP-2 和溶酶體整合膜蛋白 (lysosomal integralmembrane protein, LIMP-2)。可用免疫組化或Western blot 的方法檢測(cè)溶酶體重要膜蛋白的水平,并與其他自噬相關(guān)蛋白結(jié)合使用。

　　1.3 自噬底物

　　p62 也被稱為SQSTM1, 在多種細(xì)胞和組織中都有表達(dá), 可作為一個(gè)貨車(chē)蛋白參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。p62 可連接LC3 和泛素化的底物, 隨后被整合到自噬體中, 并在自噬溶酶體中被降解。當(dāng)自噬被激活時(shí)自噬體與溶酶體融合, 自噬囊泡中p62 等蛋白或細(xì)胞器被溶酶體酶降解, p62 水平降低; 當(dāng)自噬被抑制時(shí)自噬體積累, p62 水平升高。因此, 可以用Western blot 方法檢測(cè)p62 的水平, 作為自噬能力變化的指征。

　　除了與LC3 和泛素化蛋白結(jié)合外, p62 可能還參與形成雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物 (target of rapamycincomplex 1, TORC1)。p62 還與蛋白酶體功能相關(guān)。當(dāng)?shù)鞍酌阁w功能被抑制時(shí), p62 水平也會(huì)增高。此外,p62 也是鈣依賴的非溶酶體蛋白酶calpain 1 的底物,因此很難解釋它在自噬與死亡檢測(cè)中的意義。在自噬被激活時(shí), LC3 的上調(diào)和p62 的表達(dá)下降不一定有明顯的關(guān)聯(lián)。盡管p62 可以作為自噬損害或者自噬流改變的輔助標(biāo)志, 但最好聯(lián)合其他指標(biāo)如LC3 進(jìn)行自噬流的評(píng)估。