結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的以呼吸道病變?yōu)橹鞯囊环N慢性的傳染病。據世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計，僅2013年約900萬例新發(fā)結核病病例，約150萬人死亡。卡介苗(BacillusCalmetteGuerinvaccine，BCG)是使用最廣泛、最安全的預防結核病的唯一疫苗，但它在不同地區(qū)和接種人群中免疫效果不穩(wěn)定，為0%～80%不等，其具體的機制不明。鋅依賴的金屬蛋白酶1(zinc-dependentmetalloprotease1，Zmp1)是MTB的一種毒力因子。Zmp1與MTB的致病關系密切，可影響吞噬體與溶酶體的融合而使MTB逃避免疫清除。巨噬細胞是MTB感染與免疫形成的關鍵細胞，巨噬細胞的凋亡在機體抵抗病原菌的感染有重要作用。BCG中的Zmp1對巨噬細胞的增殖凋亡有無影響目前尚無相關文獻報道。本研究旨在構建BCG的zmp1基因含增強型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)的真核表達質粒pEGFPN1-zmp1，并轉染RAW264.7巨噬細胞，觀察zmp1基因表達產物對巨噬細胞凋亡的影響。為進一步明確Zmp1對巨噬細胞的作用、Zmp1對免疫功能的影響奠定基礎。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　pEGFP-N1質粒、Top10菌株、BCG菌株(丹麥株)均由重慶醫(yī)科大學分子醫(yī)學與腫瘤研究中心實驗室保存;RAW264.7細胞由重慶醫(yī)科大學生命科學研究院惠贈;500bpDNAladder購自北京天根生化科技有限公司;限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ均購自大連寶生物工程有限公司;1×高糖DMEM、2.5g/L胰蛋白酶溶液、胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)均購自Hyclone公司、LipofectamineTM2000Reagent均購自Invitrogen公司。藻紅蛋白標記的膜聯(lián)素Ⅴ/7-氨基放線菌素D(annexinⅤ-phycoerythrin/7-amino-actinomycin，annexinⅤ-PE/7-AAD)雙染色試劑盒購自上海前塵生物科技有限公司。

　　1.2方法

　　1.2.1引物設計及合成根據GenBank登錄的zmp1基因序列(NP_214712.1)，以真核表達質粒pEGFP-N1為框架設計2條zmp1基因PCR擴增引物并添加酶切位點，上、下游引物序列分別如下(酶切位點為波浪線部分):P1:5'-AAACTCGAGGCCACCATGGTGACACTTGCCATCCCC-3';P2:5'-AAAGGATCCGTTCCAGATCCGG-3';P1設計限制性內切酶XhoⅠ酶切位點，同時引入Kozak序列(劃線部分)和起始密碼子(ATG);P2設計限制性內切酶BamHⅠ酶切位點，同時刪除zmp1基因C端的終止密碼子，引物交由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。

　　1.2.2構建真核表達質粒pEGFP-N1-zmp1BCG菌全基因組DNA為模板，PCR法擴增zmp1基因片段，反應體系50μL:5×高保真酶緩沖液10μL，高保真酶1μL，BCG菌全基因組DNA1μL，dNTP混合物4μL，引物P1和P2各1μL，滅菌雙蒸水32μL。反應條件:95℃預變性10min，(95℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸2min)×32個循環(huán);72℃延伸10min;反應產物16℃降溫5min。經10g/L瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，按照試劑盒說明書進行回收純化大小約2000bp的特異性PCR產物。PCR產物和pEGFP-N1質粒經XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收純化zmp1片段和質粒片段;連接質粒片段與zmp1基因片段連接反應體系(20.0μL):10×T4緩沖液2.0μL、T4DNA連接酶1.0μL、pEGFP-N1質粒片段1.0μL、zmp1基因雙酶切產物10.0μL、滅菌雙蒸水6.0μL、4℃連接12h。將連接產物轉入E.coliTop10感受態(tài)細胞中，用LB(含卡那霉素20μg/mL)平板篩選陽性克隆，挑取陽性克隆單菌落接種到5mLLB(含卡那霉素20μg/mL)液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～14h，提取質粒。

　　1.2.3重組質粒鑒定菌落PCR法篩選鑒定陽性克隆，以挑單菌落的菌液為模板克隆zmp1基因;10g/L瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，分析結果。提取陽性克隆菌質粒酶切鑒定，經XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定，酶切反應產物經10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析結果。對雙酶切鑒定正確的重組質粒進行核酸DNA雙向測序鑒定。

　　1.2.4重組質粒在RAW264.7細胞中表達將核酸測序正確的重組質粒用脂質體LipofectamineTM2000轉染RAW264.7細胞，37℃恒溫50mL/LCO2靜置培養(yǎng)，同時以pEGFP-N1質粒轉染RAW264.7細胞作為對照組。轉染后24h，熒光倒置顯微鏡觀察熒光表達。

　　1.2.5實時熒光定量PCR檢測zmp1mRNA表達水平質粒pEGFP-N1-zmp1轉染RAW264.7細胞48h后，根據RNA提取試劑盒說明書提取RAW264.7細胞總RNA;按照TaKaRaPrimeScriptTMⅡ1stStrandcDNASynthesisKit說明書逆轉錄合成cDNA。實時熒光定量PCR擴增zmp1基因上、下游引物(P3、P4)和β-actin上、下游引物(P5、P6)。P3為5'-ACGGGGGCGAGAGCCGTGAC-3'，P4為5'-CCAGTCTTCAACGTTAACGC-3';P5為5'-AACTCCATCATGAAGTGTGAC-3'，P6為5'-TAACGCAACTAAGTCATAGTC-3'。實時熒光定量PCR反應體系(15.0μL):SYBRK7.5μL、P3/P50.3μL、P4/P60.3μL、cDNA3.0μL、滅菌雙蒸水6.6μL;95℃5min、95℃10s、60℃15s、72℃20s，循環(huán)39次;72℃延伸6min。

　　1.2.6流式細胞術檢測Zmp1蛋白對巨噬細胞凋亡影響實驗分為3組，空白組(未轉染質粒組)、轉染pEGFP-N1質粒組(空質粒對照組)、轉染pEGFP-N1-zmp1質粒組(實驗組);轉染后48h，用不含EDTA的2.5g/L胰蛋白酶消化收集細胞，室溫下1500r/min離心5min，棄上清;適量PBS洗滌細胞2～3次;以1×結合緩沖液調整細胞數為1×106個/mL;取100μL細胞懸液于5mL流式管中，加入5μLannexinⅤ-PE和10μL7-AAD，輕輕混勻;避光、室溫反應15min;加入400μL1×結合緩沖液，混勻，流式細胞術檢測，每組實驗分別獨立重復3次。

　　2結果

　　2.1zmp1基因片段的擴增和鑒定

　　分別以BCG基因組和重組質粒為模板，PCR擴增zmp1基因片段，PCR產物經10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，在2000bp左右出現(xiàn)特異性條帶，條帶大小與預期值相同。重組質粒pEGFP-N1-zmp1經XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，產物經10g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，分別得到大小約4700bp和2000bp的條帶。重組質粒DNA測序結果與GenBank登錄的MTB中zmp1(NP_214712.1)基因序列比對顯示完全相同，提示zmp1成功插入pEGFP-N1質粒中。

　　2.2zmp1mRNA在巨噬細胞中的表達和鑒定

　　轉染后48h，提取細胞總RNA并通過逆轉錄反應合成cDNA，以cDNA作為模板和β-actin作為內參檢測zmp1的表達。結果顯示，僅pEGFP-N1-zmp1轉染組檢測到zmp1mRNA表達，pEGFP-N1轉染組和空白對照組(未轉染)均未檢測到zmp1mRNA表達。

　　2.3各組RAW264.7細胞凋亡檢測

　　流式細胞術檢測細胞凋亡數據分析顯示，轉染后48h，實驗組與空白組和對照組比較，早期凋亡率和壞死率有所增高，存活率有所下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

　　3討論

　　巨噬細胞既是分枝桿菌感染的宿主細胞，又是一種抗感染的免疫細胞，它的正常功能狀態(tài)直接影響到分枝桿菌在細胞內的轉歸和結局。巨噬細胞凋亡在分枝桿菌感染的過程中是一種常發(fā)事件，現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，分枝桿菌的多種分子可通過調節(jié)巨噬細胞的凋亡影響巨噬細胞的功能。一般認為，分枝桿菌感染后，誘導巨噬細胞的凋亡，通過形成凋亡小體，被活化的吞噬細胞吞噬消化有利于分枝桿菌的清除，這對于菌體抵抗分枝桿菌的感染有著重要作用。而有些致病力比較強的分枝桿菌，如MTB則通過它表達的分子抑制巨噬細胞凋亡過程，達到逃避免疫殺傷、潛伏的目的。相反，毒力弱的分枝桿菌如H37Ra、BCG等則常常促進巨噬細胞的凋亡。

　　Zmp1由MTB的Rv0198c基因編碼，它是分枝桿菌的重要毒力分子，刪除zmp1基因的BCG對動物的免疫保護性增強。它可通過抑制caspase-1激活，抑制炎性復合體激活和炎性趨化因子白細胞介素1β(interleukin1β，IL-1β)分泌，阻止吞噬體活化成熟，進而阻止吞噬溶酶體的結合和融合，影響后續(xù)的殺菌過程及特異性抗MTB免疫的激發(fā)。但它對巨噬細胞的增殖、凋亡的影響，尤其是巨噬細胞凋亡的影響還未見相關的報道。

　　因此，本實驗設計重組的Zmp1胞內表達來觀察該分子是否對巨噬細胞的凋亡是否產生影響，以利于后續(xù)的功能研究。實驗中我們選用的RAW264.7巨噬細胞，生長旺盛能連續(xù)穩(wěn)定分裂增殖，是研究巨噬細功能的常用細胞株。同時構建的質粒會表達綠色熒光蛋白，有利于我們的對蛋白表達的觀察。流式細胞術是檢測細胞凋亡的常用方法，我們采用annexinⅤ-PE和7-AAD來標記Zmp1作用的巨噬細胞，通過流式細胞術來檢測細胞凋亡可了解Zmp1蛋白對細胞凋亡的影響。結果顯示，重組蛋白Zmp1胞內表達可引起巨噬細胞早期凋亡率增高，這與Aguiló等的研究結論類似。本研究的結果為進一步研究Zmp1蛋白通過何種機制導致巨噬細胞凋亡，對巨噬細胞的免疫功能產生何種影響的研究奠定了基礎。