治療腦內(nèi)疾病的必要途徑需將藥物靶向性輸送入腦內(nèi)。以腦靶向性的蛋白或多肽作為載體，可能會實現(xiàn)藥物的腦靶向轉(zhuǎn)運。我們實驗室以往的研究表明，狂犬病毒糖蛋白(rabiesvirusglycoprotein，RVG)的衍生肽RDP(RVG-derivedpeptide)，可攜帶核酸、蛋白等生物大分子入腦。脂質(zhì)體是一種安全有效的藥物遞送方式。脂溶性化合物可被包裹在脂質(zhì)體內(nèi)核中，在體內(nèi)安全釋出以發(fā)揮作用。此外，脂質(zhì)體較易修飾，從而可使其具有靶向性和高效性。本研究將在脂質(zhì)體表面的PEG鏈端連接RDP多肽，以具有抗腫瘤效果的天然植物提取物姜黃素為模型藥物，研究該RDP修飾脂質(zhì)體的腦靶向作用，從而可能為向腦內(nèi)送脂溶性化合物以治療腦部疾病，提供一種嶄新的途徑和方法。

1 材料與方法

　　1.1 試劑

　　姜黃素，純度>98%，購自美國Sigma公司;大豆卵磷脂、膽固醇，純度>95%，均購自上海Aladdin公司;DSPE-PEG-NHS(PEGMW 2000)，購自美國Nanocs公司;Cys-RDP，純度>95%，購自上海吉爾公司;乙酸乙酯、乙腈、冰醋酸均為色譜純。

　　1.2 儀器

　　高效液相色譜儀(包含SPD-M20A檢測器和LC-20AD泵)，購自日本島津公司;激光粒度及zeta電位分析儀(NanoZS)，購自英國馬爾文公司;生物質(zhì)譜儀autoflexspeedMALDI-TOF/TOF，購自德國BrukerDaltonic公司;AB135-S電子分析天平，購自瑞士梅特勒-托利多公司;BF-2000氮氣吹干儀，購自上海八方世紀(jì)科技有限公司;XHF-D高速分散器，購自寧波新芝生物科技有限公司。

　　1.3 細(xì)胞株及培養(yǎng)體系

　　人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U-87MG(實驗室凍存)，采用含10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2、飽和濕度下的培養(yǎng)箱內(nèi)。隔天換液，待細(xì)胞密度長至80% ～90%時，按照1∶3的比例傳代。傳代時，加入消化液一定時間后去除，用培養(yǎng)基吹打成單個細(xì)胞懸液，取生長良好、活性大于98%的細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

　　1.4 實驗動物

　　昆明小鼠80只，♂各半，體質(zhì)量(20±2)g，購自于重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)于西南大學(xué)藥學(xué)院SPF小鼠飼養(yǎng)室，恒溫、恒濕，自由進食、進水。

　　1.5 脂質(zhì)體的制備和表征

　　1.5.1 導(dǎo)向化合物的合成

　　按照摩爾比2∶1的比例精密稱取DSPE-PEG-NHS和RDP溶于DMF中，然后加入20μL的N-甲基嗎啉，置于4mL離心管中，在攪拌器中避光攪拌48h。取出反應(yīng)液，置于透析袋(MW 3500)中，放入2L去離子水中透析48h后(每6h換水1次)，冷凍干燥，-20℃保存。

　　1.5.2 脂質(zhì)體的制備

　　采用薄膜分散法分別制備姜黃素脂質(zhì)體(CUR-L)和RDP修飾的姜黃素隱形脂質(zhì)體(RDP-CUR-L)。按照處方量(Tab1)精密稱取各種脂材于10mL茄形瓶中，加入氯仿3mL溶解，37℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10min，使其成均勻的薄膜。然后加入1mL去離子水，37℃于水浴搖床中水化1h，形成懸浮液，間歇超聲90s，得到澄清透明呈淡黃色乳光的脂質(zhì)體溶液，并分別過100nm的膜使粒徑分布均勻，4℃冰箱內(nèi)保存。

　　1.5.3 DSPE-PEG-RDP比例篩選

　　按上述脂質(zhì)體制備方法制備一系列含不同比例DSPE-PEG-RDP的含藥靶向脂質(zhì)體(DSPE-PEG-RDP分別為總摩爾量的0.5%、1.0%、2.0%和5.0%)。采用MTT法考察不同密度下的RDP-CUR-L對U87MG細(xì)胞抑制率的影響。取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化液消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107·L-1，以每孔500μL(5000個/孔)接種于96孔板，培養(yǎng)24h貼壁后加入不同濃度的CUR-L和RDP-CUR-L，濃度依次為150、75、37.5、18.8、9.4、4.7μmol·L-1，孵育48h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入濃度為5g·L-1的MTT(20μL)，37℃培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μL二甲基亞砜(DMSO)溶解藍(lán)紫色甲#顆粒，用酶標(biāo)儀在波長為490nm下測定光吸收值(OD)。每組實驗重復(fù)3次，每個樣品做3個平行樣。全部實驗均設(shè)DMSO對照組。計算藥物抑制率和對腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。藥物抑制率/% =(1-OD實驗組-OD空白組/OD對照組-OD對照組)×100%1.5.4 脂質(zhì)體粒徑、電位、分散度測定 用激光粒度及zeta電位分析儀分別測定CUR-L和RDP-CUR-L的粒徑、Zeta電位、分散度(PDI)。

　　1.5.5 脂質(zhì)體包封率測定

　　采用透析破乳法，取用均質(zhì)機處理過的CUR-L和RDP-CUR-L，每組實驗分成兩份(每份400μL)：一份用透析液透析6h后，收集脂質(zhì)體部分，以10%的TritonX-100破乳，經(jīng)HPLC測定包裹在脂質(zhì)體內(nèi)的藥物濃度C;另一份直接破乳，經(jīng)HPLC測定姜黃素得到C0，按照公式計算出包封率(包封率=C/C0×100%)。

　　1.5.6 脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察

　　取制得的CUR-L和RDP-CUR-L，分成兩個實驗組，每組平行3次，分別于3、7、15、30、45、60d后肉眼觀察脂質(zhì)體溶液變化，HPLC測包封率。

　　1.5.7 體外釋放度測定

　　采用動態(tài)透析法(dynam-icdialysis)，按中國藥典2010版附錄XC第三法(小杯法)測定釋放度。精密量取制劑CUR-L、RDP-CUR-L各0.5mL，經(jīng)釋放介質(zhì)稀釋至3mL，裝于透析袋內(nèi)(截留分子質(zhì)量為8000u)，兩端扎牢，放入150mL釋放介質(zhì)中，釋放介質(zhì)為含有0.2%十二烷基硫酸鈉的人工胃液，37℃ 下姜黃素在此釋放介質(zhì)中的溶解度為80mg·L-1，滿足漏槽條件。37℃恒溫水浴攪拌(轉(zhuǎn)速為100r· min-1)。分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24h各個時間點取樣0.3mL，并及時補充等溫的相同體積空白介質(zhì)。微孔濾膜過濾，按照HPLC方法檢測姜黃素含量，并計算累積釋藥百分率(%)。

　　1.6 姜黃素懸浮液和脂質(zhì)體的體內(nèi)分布

　　1.6.1 色譜條件

　　C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm，大連依利特分析儀器公司);流動相：乙腈∶4%冰醋酸(48∶52)，流速：1mL·min-1，檢測波長：430nm，柱溫：25℃。

　　1.6.2 樣品預(yù)處理

　　將姜黃素溶解于1%羧甲基纖維素鈉中，配制成濃度為1g·L-1的CUR混懸液，制得的CUR-L和RDP-CUR-L濃度均為1g·L-1，CUR、CUR-L、RDP-CUR-L均按照姜黃素30mg·kg-1的劑量于小鼠尾靜脈注射給藥。取昆明小鼠，禁食12h，尾靜脈分別注射CUR、CUR-L、RDP-CUR-L，于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12h各個時間點分別取小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦(每個時間點3只)，用生理鹽水清洗后用濾紙吸干，剪碎，精密稱重，加入1mL生理鹽水，用組織勻漿器勻漿，加入1mL乙酸乙酯，渦旋3min，3000r·min-1離心10min，精密吸取上清液，再加入相同體積的乙酸乙酯，萃取2次，合并上清液，氮氣吹干，加入10倍體積的流動相，超聲、渦旋使其充分溶解，過膜后進樣。

　　1.6.3 方法學(xué)考察

　　專屬性：取小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦各空白組織勻漿液0.3mL，樣品處理后采用HPLC法分別進樣測定空白樣品、空白樣品加內(nèi)標(biāo)及小鼠尾靜脈注射給藥后的樣品。標(biāo)準(zhǔn)曲線：取小鼠空白組織勻漿液，精密加入姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成1.6、3.1、6.2、12.5、25、50mg·L-1系列濃度的樣品溶液，樣品處理后，以姜黃素的峰面積與樣品中姜黃素的濃度(C)進行線性回歸。回收率與精密度：配制低、中、高濃度(3、12.5、50mg·L-1)的姜黃素質(zhì)控樣品，各5份，按“樣品處理”項下方法處理，進樣測定。以姜黃素的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算出姜黃素的濃度，與實際加入量比較，計算方法回收率，用以表示準(zhǔn)確度;以相應(yīng)低、中、高濃度的姜黃素對照品溶液直接進樣，以質(zhì)控樣品中姜黃素峰面積與對照品溶液中姜黃素峰面積比較，計算提取回收率;1d內(nèi)進樣測定5次，連續(xù)測定5d，計算日內(nèi)RSD和日間RSD。